直接靶板微滴法快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌替加環(huán)素和多黏菌素的敏感性

夏兆新,楊文蘇,朱 毅,胡心益,林春暉,蔣 童,沈繼錄

肺炎克雷伯菌是重要的院內(nèi)感染病原體,其耐藥性在全球范圍內(nèi)不斷增加,且治療藥物愈發(fā)受限,是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。替加環(huán)素和多黏菌素是治療這些致病菌感染的重要藥物[2-3]。然而隨著其在臨床抗感染治療中的逐漸使用,近年來(lái)也不斷有對(duì)其耐藥的菌株被分離出來(lái)[4-5]。CHINET數(shù)據(jù)[6]顯示,2021年肺炎克雷伯菌的替加環(huán)素耐藥率為4.2%,中介率為7.0%,而多黏菌素在克雷伯菌屬中的耐藥率也達(dá)到3.9%。目前臨床上常用紙片擴(kuò)散法,或基于微量肉湯稀釋法來(lái)檢測(cè)替加環(huán)素和多黏菌素的敏感性,然而其操作繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),可能會(huì)延誤治療。為了優(yōu)化替加環(huán)素和多黏菌素的使用,該研究基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)[7-8]進(jìn)行直接靶板微滴生長(zhǎng)法(direct-on-target micro-droplet growth assay,DOT-MGA),預(yù)測(cè)替加環(huán)素和多黏菌素的敏感性,評(píng)估數(shù)小時(shí)內(nèi)快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌耐藥表型的可行性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源共收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌67株,其中27株對(duì)替加環(huán)素耐藥菌,13株對(duì)多黏菌素耐藥,27株對(duì)兩種抗生素敏感。所有菌株均經(jīng)過(guò)MALDI-TOF MS(德國(guó)Bruker公司)鑒定,確定菌種。

1.2 材料與試劑MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀,質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)液及MALDI-TOF MS靶板均購(gòu)自德國(guó)Bruker公司;替加環(huán)素、多黏菌素和CAMHB肉湯粉末(陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司;ATCC27853和ATCC25922作為微量肉湯稀釋法和MALDI-TOF MS鑒定所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株,為安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.3 微量肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定替加環(huán)素的MIC。根據(jù)美國(guó)食品藥品管理局臨床折點(diǎn),解釋替加環(huán)素敏感性(MIC≥8 mg/L為耐藥,MIC=4 mg/L為中介,MIC≤2 mg/L為敏感),ATCC25922作為參考菌株;根據(jù)歐洲抗菌藥敏感性試驗(yàn)委員會(huì)臨床折點(diǎn),解釋多黏菌素敏感性(MIC≥4 mg/L為耐藥,MIC≤2 mg/L為敏感),ATCC27853和ATCC25922作為參考菌株。

1.4 DOT-MGA在96孔微量滴定板孔中先加入100 μl菌液,后加入100 μl的MH肉湯(含或不含抗生素,其終濃度為2 μg/ml),不含抗生素的孔用作該樣品的生長(zhǎng)對(duì)照孔。然后取6 μl混合液微滴轉(zhuǎn)移到MALDI-TOF MS靶板孔上,一式三份進(jìn)行,3個(gè)孔含有抗生素,另外3個(gè)孔不含抗生素。將接種好的靶板放入塑料運(yùn)輸盒中,在盒底部加入4 ml去離子水,用作濕盒。置于溫箱中于(35±1)℃分別孵育3、4、6、8 h后,使用無(wú)塵紙將肉湯從靶板上移除。待靶板上剩余菌液完全干燥后,加入1 μl基質(zhì)液覆蓋靶點(diǎn),手動(dòng)收集MALDI-TOF質(zhì)譜光譜,并由MALDI Biotyper 3軟件(Bruker Daltonik)評(píng)估。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取13株敏感和13株耐藥的細(xì)菌,分別設(shè)置了3、4、6和8 h的孵育時(shí)間后,對(duì)所有菌株進(jìn)行DOT-MGA進(jìn)行檢測(cè)。

在生長(zhǎng)對(duì)照鑒定得分≥1.7分的情況下,該組測(cè)試判定為有效。含有替加環(huán)素或多黏菌素的樣本,成功鑒定(得分≥1.7分)被解釋為非敏感(中介或耐藥)結(jié)果NS (no susceptible),而鑒定失敗(得分<1.7分)定義為敏感S (susceptible)。

1.5 數(shù)據(jù)處理DOT-MGA的最終結(jié)果分別與微量肉湯稀釋法的結(jié)果進(jìn)行比較,按照如下公式計(jì)算有效率、敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及分類(lèi)一致率(categorical agreement,CA)。CA即被評(píng)估方法的結(jié)果與微量肉湯稀釋法藥敏結(jié)果一致的菌株所占百分比。見(jiàn)表1。

表1 DOT-MGA數(shù)據(jù)處理

靈敏度=a/(a+c);特異度=d/(b+d);陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=a/(a+b);陰性預(yù)測(cè)值=d/(c+d)

2 結(jié)果

研究[7,9]報(bào)道中顯示,DOT-MGA試驗(yàn)以6 μl液滴培養(yǎng)可以獲得最佳檢測(cè)性能。在本研究前期實(shí)驗(yàn)中以4、6、8 μl作為比較,發(fā)現(xiàn)液滴體積過(guò)小,小于4 μl細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,超過(guò)6 μl則容易溢出靶板孔,造成交叉污染,6 μl可以很好的固定在孔內(nèi),獲得最佳的生長(zhǎng)狀態(tài),于是后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用6 μl的體積來(lái)摸索最佳孵育時(shí)間。

2.1 替加環(huán)素的DOT-MGA結(jié)果替加環(huán)素DOT-MGA預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)3 h后,細(xì)菌生長(zhǎng)的有效率為88.46%,CA為73.91%,細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不好,不能被正確檢測(cè)。而4 h后,細(xì)菌生長(zhǎng)的有效率為100.00%,CA為96.15%,其靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為92.31%、100.00%、100.00%、92.86%,已達(dá)到最佳狀態(tài),隨著時(shí)間延長(zhǎng)到6 h和8 h,檢測(cè)性能未能得到明顯的提高。擴(kuò)大菌株量,對(duì)所收集到的54株菌株,以6 μl液滴,孵育4 h后,經(jīng)過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè),與微量肉湯稀釋法對(duì)比后,只有1株菌存在中介判斷為敏感,存在微小誤差,其他結(jié)果均一致。DOT-MGA的有效率、CA、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100.00%、98.15%、96.30%、100.00%、100.00%、96.45%,與微量肉湯稀釋法的結(jié)果具有良好的一致性。見(jiàn)表2。

表2 DOT-MG對(duì)替加環(huán)素非敏感菌株的鑒定性能

2.2 多黏菌素的DOT-MGA結(jié)果本研究共收集到13株多黏菌素不敏感的菌株,又隨機(jī)選取了13株多黏菌素敏感的菌株進(jìn)行DOT-MGA實(shí)驗(yàn),在3 h孵育時(shí)間下生長(zhǎng)有效率為92.15%,而4、6、8 h孵育時(shí)間下,生長(zhǎng)對(duì)照孔均能有效鑒定出,生長(zhǎng)有效率為100.00%,而在孵育4 h后,DOT-MGA的鑒定性能達(dá)到最佳,其CA、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為96.15%、92.31%、100.00%、100.00%、92.86%,孵育時(shí)間延長(zhǎng)到6 h和8 h,檢測(cè)性能與4 h的結(jié)果一致。見(jiàn)表3。

表3 靶板微滴生長(zhǎng)法對(duì)多黏菌素非敏感菌株的鑒定性能

3 討論

目前,微量肉湯稀釋法是抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。臨床常用的VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)是基于該方法進(jìn)行藥物MIC值的檢測(cè),但其結(jié)果通常不能在同一天內(nèi)獲得,從而可能延誤有效的治療,微生物的快速藥敏檢測(cè)仍然是急需解決的問(wèn)題。DOT-MGA是基于微量肉湯稀釋法原理,利用MALDI-TOF MS儀器具有更高的檢測(cè)性能,縮短常規(guī)肉湯稀釋法的孵育時(shí)間,從而達(dá)到快速檢測(cè)的效果,且與肉眼觀察結(jié)果比較,既可以排除主觀因素的干擾,也可以提高其準(zhǔn)確性和靈敏度,這一方法受到了人們的廣泛關(guān)注[11-14]。有學(xué)者將美羅培南與肺炎克雷伯菌和腸桿菌共同孵育,利用DOT-MGA在4 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速檢出該菌對(duì)碳青霉烯酶的非敏感性和碳青霉烯酶的分型[15-16]。本研究收集了臨床分離的27株替加環(huán)素不敏感的菌株和13株多黏菌素不敏感的菌株,探究DOT-MGA對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌的表型檢測(cè)性能。結(jié)果顯示,在與替加環(huán)素、多黏菌素共同孵育4 h后,大部分肺炎克雷伯菌便可以被MALDI-TOF MS儀檢測(cè)出,其抗生素敏感性的結(jié)果與肉湯稀釋法相比具有較高的一致性,替加環(huán)素和多黏菌素的生長(zhǎng)有效率均為100.00%,CA分別為98.15%和96.15%。在替加環(huán)素DOT-MGA實(shí)驗(yàn)中,54株菌中有1株菌(MIC=4 μg/ml,I)由中介誤判為敏感,存在微小誤差,多黏菌素DOT-MGA實(shí)驗(yàn)中,26株菌有1株菌(MIC=4 μg/ml,R)由耐藥誤判為敏感,存在非常重大誤差,這可能是因?yàn)樵摼鶰IC值與選取的折點(diǎn)藥物濃度相近(2 μg/ml),而配置過(guò)程中存在認(rèn)為誤差引起。

DOT-MGA也同樣可以推廣到許多不同的微生物和抗生素檢測(cè)中,Idelevich et al[17]評(píng)估了DOT-MGA檢測(cè)頭孢呋辛、厄他培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素等多種抗生素的性能。但DOT-MGA檢測(cè)需要優(yōu)化抗生素-生物體組合條件,摸索最適孵育時(shí)間以獲得最佳檢測(cè)性能。在本研究中,孵育時(shí)間為3 h時(shí),部分細(xì)菌生長(zhǎng)控制無(wú)法檢測(cè)出,這可能是孵育時(shí)間過(guò)短,細(xì)菌含量低,細(xì)菌黏液性高,從而光譜較差,儀器無(wú)法檢測(cè)出。而無(wú)抗生素孵育組,盡管生長(zhǎng)控制孔已達(dá)到了儀器的檢測(cè)限,但加藥后偶爾也有幾個(gè)替加環(huán)素或多黏菌素耐藥的菌株生長(zhǎng)仍未達(dá)到檢測(cè)要求,這主要與微生物自身的生長(zhǎng)狀況有關(guān),生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)與抗生素競(jìng)爭(zhēng),而過(guò)長(zhǎng)的孵育時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng),并可能產(chǎn)生其他雜菌,從而無(wú)法做出準(zhǔn)確的判斷。適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間應(yīng)允許可以成功檢測(cè)的細(xì)菌生長(zhǎng)控制,同時(shí)可以準(zhǔn)確表征細(xì)菌對(duì)抗生素的易感性。本研究中替加環(huán)素DOT-MGA組,有一株菌在兩次4 h孵育鑒定中,一次未檢出,一次可以正確預(yù)測(cè),這個(gè)誤差可能受操作過(guò)程中吸水紙吸取液滴不當(dāng)或靶板清潔程度等多種因素的影響。因此,在摸索多種抗生素-細(xì)菌組合的最佳檢測(cè)條件后,開(kāi)發(fā)出一種含有固定含量抗生素的一次性靶板,改進(jìn)棄去液滴的方式,規(guī)范操作流程,從而減小實(shí)驗(yàn)中的誤差,更好用于臨床藥物敏感性的檢測(cè)。

本研究?jī)H對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素這兩種藥物進(jìn)行評(píng)估,研究表明DOT-MGA法可以在4 h孵育后檢測(cè)對(duì)替加環(huán)素、多黏菌素敏感和不敏感的菌株,未對(duì)其他抗生素進(jìn)行評(píng)估,但其他抗生素尤其是碳青霉烯類(lèi)藥物的檢測(cè)先前已有報(bào)道,Idelevich et al驗(yàn)證了多種抗生素在孵育4 h后便可獲得最佳檢測(cè)性能[17]。替加環(huán)素、多黏菌素耐藥的菌株難以收集,實(shí)驗(yàn)中的菌株量有限,仍需擴(kuò)大樣本量和細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。其中Horseman et al[11]的研究也表明DOT-MGA法在金黃色葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌四種常見(jiàn)病原菌的藥敏鑒定中同樣具有很高的準(zhǔn)確性。DOT-MGA方法在其他不同菌種的藥物敏感性檢測(cè)中可能也具有很大的潛能。

綜上所述,DOT-MGA方法可以快速鑒別替加環(huán)素和多黏菌素的敏感性,并可能用于不同菌種、不同抗生素敏感性的鑒別,這為臨床微生物抗生素快速檢測(cè)提供新的思路,對(duì)臨床多重耐藥菌的抗感染治療具有重大意義。