SPARCL1基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化遺傳易感相關(guān)性分析

陳心嚴(yán),程 煦,陳婷婷,王 華,張 敏,朱華慶,程筱雯

全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告[1]顯示,由動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)引起的心腦血管疾病是現(xiàn)代社會(huì)威脅人類健康的首要原因。AS的發(fā)生原因較復(fù)雜,包括環(huán)境和遺傳因素等[2-4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)構(gòu)成90%以上人類基因組遺傳變異,目前已發(fā)現(xiàn)很多與AS有關(guān)聯(lián)的易感基因位點(diǎn)[5]。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteine-like 1,SPARCL1)是一種胞外基質(zhì)蛋白,具有抗黏附、參與細(xì)胞增殖和遷移的功能[6]。相同的組織中,SPARCL1在疾病狀況下表達(dá)有所變化。SPARCL1在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào),認(rèn)為SPARCL1可能有抑癌作用[7-10]。目前尚未見SPARCL1與AS關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道,也鮮有關(guān)于SPARCL1基因多態(tài)性的研究。該研究擬通過病例對(duì)照研究,分析SPARCL1在AS患者和健康對(duì)照者中的表達(dá)情況及SPARCL1的SNP位點(diǎn)(rs7695558和rs1049539)與AS的相關(guān)性,探討SPARCL1在AS發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用,為AS的診療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2019年12月—2020年6月收治的209例AS患者為研究對(duì)象,同一時(shí)期的208例健康體檢者為對(duì)照組。隨機(jī)選擇其中51例AS患者和年齡性別相匹配的50例健康體檢者的全血用于提取DNA。后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)所用冠狀動(dòng)脈組織源自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理中心的臨床解剖組織標(biāo)本(10例)。所有AS的診斷均經(jīng)臨床確立。對(duì)照組經(jīng)臨床檢查排除心腦血管疾病,且肝腎功能正常,與病例組年齡、性別相匹配。本研究所選取的研究對(duì)象與健康體檢者均來自安徽省。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集與DNA提取 采集空腹靜脈血,全血用于提取DNA,促凝血離心分離后收集的血清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。嚴(yán)格按照試劑盒的說明書,從全血標(biāo)本中提取基因組DNA。使用NanoDrop one(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)DNA含量,樣品DNA的A260/A280在1.8～2.0之間時(shí),認(rèn)為已達(dá)到所要求的純度。

1.2.2ELISA試驗(yàn) 嚴(yán)格按照人SPARCL1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)的說明書操作。酶標(biāo)板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、空白孔(樣本孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔),經(jīng)加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、測(cè)定等步驟后,用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值,計(jì)算樣品濃度。

1.2.3免疫組織化學(xué) 3 μm厚的石蠟組織切片經(jīng)65 ℃烤片2 h后脫蠟水化,并在檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L,pH 6.0)中微波加熱以修復(fù)抗原。然后加入適量?jī)?nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫阻斷10 min,用PBS緩沖液沖洗3 min×3次,然后將切片與多克隆抗SPARCL1抗體(proteintech,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)以1 ∶200的稀釋度在37 ℃溫箱孵育1 h,PBS緩沖液沖洗3 min×3次,再滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育20 min,PBS緩沖液沖洗3 min×3次,最后進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.4SNP基因分型 在LightCycler480 熒光定量PCR儀上通過高分辨率熔解曲線分析(high resolution melting,HRM)對(duì)樣本進(jìn)行基因分型。PCR在96孔板中以20 μl的體積進(jìn)行,包括10～150 ng的DNA,2 mmol/L的每種引物,2.5 mmol/L的MgCl2,水和LightCycler480高分辨率熔解預(yù)混液。 按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán);58 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s。 通過在70～97 ℃以每1 ℃ 25次采集的速率獲得HRM曲線數(shù)據(jù)。AA和TT表示野生純合基因型,AG和TC表示雜合突變基因型,GG和CC表示純合突變基因型。

2 結(jié)果

2.1 SPARCL1 在血清中的表達(dá)情況病例組和對(duì)照組年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但AS患者的SPARCL1血清表達(dá)水平低對(duì)照組(Z=-2.916,P=0.004)。見表1。

表1 SPARCL1在病例組和對(duì)照組中血清表達(dá)水平

2.2 SPARCL1血清水平和AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的分層分析從以上AS病例人群中篩選出有AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素?cái)?shù)據(jù)的人群,420 ng/ml為該組人群SPARCL1血清水平的中位數(shù),以420 ng/ml為分組切點(diǎn),比較兩組研究對(duì)象的年齡、性別、心血管危險(xiǎn)因素等指標(biāo),結(jié)果顯示SPARCL1水平與患者年齡(P=0.027)、舒張壓有關(guān)(P=0.008),與SPARCL1血清水平低的患者比較,SPARCL1水平高的患者年齡更高且舒張壓更低。見表2。

表2 SPARCL1不同水平和AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素的組間比較

2.3 SPARCL1在血管組織中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示,冠狀動(dòng)脈組織中粥樣硬化病變部位的SPARCL1表達(dá)水平增高,以泡沫細(xì)胞表達(dá)為主。見圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)SPARCL1在AS患者冠狀動(dòng)脈組織中的表達(dá)情況

2.4 SPARCL1基因SNP位點(diǎn)rs7695558、rs1049539與AS易感性的關(guān)聯(lián)性研究從209例AS患者和208例健康體檢中隨機(jī)選擇其中51例AS患者和年齡性別相匹配的50例健康體檢者,收集全血提取DNA后通過HRM對(duì)SPARCL1的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs7695558、rs1049539進(jìn)行基因分型。rs7695558多態(tài)性型別為AA、AG、GG,在對(duì)照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。病例組中AA、AG、GG的發(fā)生頻率分別為17.65%、52.94%、29.41%;在對(duì)照組中,相應(yīng)的數(shù)據(jù)分別為10.00%、40.00%、50.00%。經(jīng)χ2檢驗(yàn),病例組和對(duì)照組關(guān)于rs7695558的基因分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.676,P=0.097)。rs1049539多態(tài)性型別為TT、TC、CC,在對(duì)照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。病例組中TT、TC、CC的發(fā)生頻率分別為47.06%、47.06%、5.88%;在對(duì)照組中,相應(yīng)的數(shù)據(jù)分別為52.00%、44.00%、4.00%。經(jīng)χ2檢驗(yàn),病例組和對(duì)照組關(guān)于rs1049539的基因分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.435,P=0.848)。對(duì)于rs7695558,在隱性遺傳模型中,含A和不含A的基因分布有差異,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低,OR=0.417,95%CI:0.184～0.945,在10%的置信水平上顯著(P=0.034)。病例組和對(duì)照組的rs1049539,在共顯性、隱性、顯性遺傳模型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組SPARCL1基因SNP位點(diǎn)rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)基因型分布情況

3 討論

AS是一種脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥性疾病,其發(fā)病原因復(fù)雜,包括遺傳及環(huán)境因素[11],SNP作為第3代遺傳標(biāo)記廣泛存在于各類物種中,成為個(gè)體差異化和疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。SPARCL1基因位于人類染色體4q22～25,該基因包括11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子[12],包含多個(gè)SNPs,其中rs7695558為內(nèi)含子突變,rs1049539為外顯子突變。先前有研究[13]報(bào)道rs7695558與阿爾茲海默患者腦中SPARCL1低表達(dá)有關(guān),表明SPARCL1在神經(jīng)炎癥中有一定作用。SPARCL1在血管炎癥中是否發(fā)揮作用尚不清楚,國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道相關(guān)文獻(xiàn)。SPARCL1基因的編碼產(chǎn)物為SPARCL1蛋白,本研究中,通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AS患者和對(duì)照組血清的SPARCL1含量有差異,結(jié)果AS患者的SPARCL1水平低于對(duì)照組,預(yù)示SPARCL1蛋白可能有血管保護(hù)作用。隨后,以血清SPARCL1濃度420 ng/ml為分組切點(diǎn),根據(jù)患者年齡、性別、心血管危險(xiǎn)因素進(jìn)行分層分析,結(jié)果表明SPARCL1水平與患者年齡、舒張壓有關(guān),與SPARCL1血清水平低的患者比較,SPARCL1水平高的患者年齡更高且舒張壓更低,進(jìn)一步表明SPARCL1可能是一種潛在的血管保護(hù)因子,但患者的性別、其他心血管危險(xiǎn)因素與SPARCL1無明顯相關(guān),后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)擴(kuò)大樣本量以及納入更多的血管危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SPARCL1蛋白在AS患者冠狀動(dòng)脈組織中粥樣硬化病變部位表達(dá)水平升高,主要表達(dá)在泡沫細(xì)胞。結(jié)合前述血清SPARCL1蛋白檢測(cè)結(jié)果分析,可能的原因是SPARCL1蛋白在AS發(fā)生發(fā)展過程中由于某種機(jī)制進(jìn)入粥樣硬化病變部位的含量增高導(dǎo)致其在血清中的含量下降。

本研究中,SPARCL1的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs7695558(A/G)和rs1049539(T/C)在病例組和對(duì)照組中的基因分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同的遺傳模型中發(fā)現(xiàn)對(duì)于rs7695558,在隱形遺傳模型中,含A和不含A的基因分布有差異,不含A等位基因(GG)的患者比含A等位基因(AA+AG)的患者的AS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低,OR=0.417,95%CI:0.184～0.945,在10%的置信水平上顯著。對(duì)于rs1049539,在共顯性、隱性、顯性遺傳模型中均未見病例組、對(duì)照組中的基因型分布有明顯差異。

綜上所述,本研究首次在中國(guó)安徽人群中鑒定了位于人類SPARCL1基因內(nèi)含子內(nèi)的與AS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的新易感位點(diǎn)rs7695558,同時(shí)提示SPARCL1可能作為血管保護(hù)因子發(fā)揮了抗AS的作用。樣本量較小為本研究的不足,課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)正在納入更多的血管危險(xiǎn)因素及其他地區(qū)的人群,擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證并進(jìn)一步在細(xì)胞水平及模式動(dòng)物水平探討SPARCL1抗AS的具體分子機(jī)制,以期評(píng)估SPARCL1成為AS診療新靶點(diǎn)的可能性。