基于NF-κB通路探究亞麻油干預心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機制

耿 蕓,宋海燕,刁學織

心肌梗死是指急性心肌缺血壞死,是臨床常見的疾病。心肌梗死早期癥狀主要以疼痛為主,臨床表現主要是突然發作的胸口壓榨性疼痛,程度較重,持續時間長,可達數小時或更長,休息及含服硝酸甘油無效,疼痛可放射至下頜、頸部、背部;有時也可表現為全身癥狀、心律失常、胃腸道癥狀等[1-3]。心肌梗死后心臟會進行心室重塑,細胞外膠原基質不斷沉積,成纖維細胞增殖,導致心肌細胞肥大、心肌纖維化及細胞凋亡[4-5]。其中心肌纖維化在心室重塑中起重要作用,心肌纖維化是心肌的自我修復和炎癥反應過程,如果纖維化加重,則心肌僵硬度增加,順應性下降,導致心臟舒張功能受損,纖維化增加,使具有收縮功能的心肌細胞比例減少,從而導致心臟收縮功能受損[6-7]。心肌纖維化的發生和腎素-血管緊張素-醛固酮系統、炎癥反應、多種細胞因子及細胞自噬等各種因素相互作用有關。核轉錄因子-κB(NF-κB)是一種廣泛的轉錄因子,能和很多基因結合,參與炎癥、免疫應答、細胞增殖凋亡等多種活動。有研究表明,心血管疾病的發生多與NF-κB信號通路有關[8]。亞麻籽富含α-亞麻酸、亞麻酸及木酚素等功能性成分,其中,α-亞麻酸是一種植物來源的n-3必需脂肪酸,是長鏈n-3不飽和脂肪酸二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的前體物質。有研究表明,膳食補充α-亞麻酸對心血管疾病的預防和治療有重要的作用[9]。心肌纖維化會造成心室重塑,導致心功能下降,傳導障礙,誘發心律失常、心力衰竭等。因此,預防心肌纖維化是心肌梗死病人治療的關鍵。本研究基于NF-κB通路探究亞麻油干預心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 54只SD大鼠(雌雄各半),遼寧長生生物技術股份有限公司提供,體質量190～220 g,溫度(22±1)℃,分6籠飼養,濕度45%～55%,大鼠活動飲水自由,給予1周時間習慣新環境,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗,動物許可證號:SYXK(遼)2019-0034。

1.2 藥物、試劑與儀器 冷榨亞麻籽油(α-亞麻酸質量分數56%)購自上海西格生物科技有限公司;卡托普利(國藥準字H19993135,規格:每片25 mg)購自云南龍恩制藥有限公司;一抗、二抗購自杭州聯科生物技術股份有限公司;小動物超聲購自上海玉研科學儀器有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;Masson染色購自無錫菩禾生物醫藥;蛋白電泳儀購自北京德元國際科技公司;三乙醇胺(TBS)緩沖液購買自滁州仕諾達生物科技有限公司。

1.3 建模及分組 分組:將54只大鼠隨機分為6組,每組9只,假手術組(control group,CO組)、模型組(model group,MO組)、亞麻油低劑量組(linseed oil low dose group,LL組)、亞麻油中劑量組(linseed oil medium dose group,LM組)、亞麻油高劑量組(linseed oil high dose group,LH組)、卡托普利組(captopril group,CA組)。建模:術前禁食水,腹膜內注射2%戊巴比妥鈉,使大鼠充分麻醉后,經喉氣管插管連接小動物呼吸機,胸部備皮消毒后,沿左側3～4肋間間隙開胸,撕開心包膜后可見心臟。心臟大靜脈作為標記,使用5-0帶線縫合針于左心耳下緣約2 mm位置結扎左冠狀動脈前降支。觀察左心室心肌的運動及顏色變化,室壁運動減弱、結扎部位及周圍心肌變白認為手術結扎成功。術后第2天進行心電圖檢查,圖紙中出現5～8個病理性Q波(觀察Ⅰ、aVL、V1～V6導聯)、ST段抬高,表明模型制備成功。CO組大鼠則將手術線穿過肺動脈圓錐與左心耳之間,不進行結扎,且無上述病理表現。

1.4 干預方法 建模成功后,LL組大鼠給予亞麻油0.025 g/kg灌胃,LM組大鼠給予亞麻油0.050 g/kg灌胃,LH組大鼠給予亞麻油0.150 g/kg灌胃,CA組大鼠給予卡托普利10 mg/kg灌胃,以上用藥均為每日1次,共干預4周,CO組及MO組大鼠不用藥,給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 超聲檢測大鼠心臟功能 以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,使用小動物超聲儀器繪制大鼠超聲心電圖,檢測大鼠心功能。探頭置于大鼠胸骨左緣3～4肋間,測量左心室射血分數(LVEF)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室短軸縮短率(LVFS)參數。

1.6 心肌組織病理學和心肌纖維化程度觀察

1.6.1 心肌組織HE染色 用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,大鼠處死后分離心臟,取心肌組織,置于4%多聚甲醛液固定24 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟包埋、切片取5 μm厚度,用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,水洗5 min,HE染色10 min,水洗,再次梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察心肌組織變化。

1.6.2 心肌組織Masson染色 取大鼠心肌組織,遵照Masson染色試劑盒操作說明處理,封片后通過顯微鏡觀察心肌纖維化程度(肌纖維呈紅色,膠原呈藍色)并照相保存;通過圖像分析系統計算膠原容積分數(CVF),CVF(%)=(膠原面積/視野總面積)×100%,每張切片隨機取5個視野測量,取平均值。

1.7 聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測大鼠心肌組織中低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、結締組織生長因子(CTGF)表達 取心肌組織50 mg放于酶EP管中,加入Trizol 1.0 mL,無核酸酶溶解,按照試劑盒提取總RNA后,進行純化,收集純化后的總RNA。取RNA母液10 μL加焦磷酸二乙酯(DEPC)水990 μL稀釋100倍,采用紫外線分光光度儀器檢測RNA純度,并計算濃度。按照逆轉錄試劑盒逆轉錄反應體系,將提取的RNA轉錄為cDNA,獲得反應體系,反應條件為:42 ℃作用60 min,72 ℃作用5 min,4 ℃終點。每個細胞設置6個復孔,以β-actin為內參,反應條件為95 ℃預作用3 min,95 ℃作用5 s,58 ℃退火,40個循環。詳見表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.8 免疫印跡法檢測大鼠心肌組織中NF-κB、NF-κB p65、TNF-α蛋白的表達 取大鼠心肌組織,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后切碎,再加1 mL細胞裂解液裂解30 min,10 000 r/min、4 ℃離心5 min,取上清液,上樣,緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用雙辛可寧酸(BCA)法檢測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內預冷,然后全部轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再加入脫脂奶粉,全程封閉時長為1 h。加入一抗NF-κB、NF-κB p65、TNF-α(稀釋比例1∶1 000)后,TBS20(TTBS)漂洗,共3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶1 000),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用博士德生產的二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒,在1 mL水中加A、B、C液各1滴,再加于膜上,電化學發光法(ECL)凝膠成像系統分析目標條帶的光密度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠超聲檢測指標比較 與CO組相比,MO組LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠超聲檢測指標比較

2.2 HE染色結果 CO組大鼠左心室的心肌細胞彼此平行,且在光學顯微鏡下呈有序排列。細胞結構未被破壞,大小正常,中心是橢圓形的核,橫向條紋明顯可見。MO組大鼠心肌細胞萎縮,細胞色素沉著,細胞質增生,心肌纖維斷裂,炎性細胞大量浸潤,纖維細胞增加。LL組、LM組、LH組、CA組染色相對均勻,梗死部位的纖維組織增生和炎性細胞浸潤、細胞結構破壞程度較模型組改善,其中,LH組和CA組改善效果較LL組和LM組明顯。詳見圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態學(×200)

2.3 Masson染色結果及CVF值 CO組大鼠心肌組織排列整齊,染色均勻,基本無膠原纖維;MO組大鼠心肌組織破壞嚴重,心肌細胞殘存較少,膠原纖維增加,出現明顯心室重塑表現;各用藥組染色相對均勻,與MO組相比,完整的心肌細胞增多,膠原纖維不同程度減少,其中,LH組和CA組改善效果較LL組和LM組明顯,心肌纖維化程度較輕。詳見圖2。

圖2 Masson染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態學(×200)

通過Image J圖像分析軟件計算各組大鼠心肌CVF結果,CO組、MO組、LL組、LM組、LH組和CA組CVF分別為(0.91±0.15)%,(22.01±1.17)%,(13.15±3.24)%,(8.48±0.76)%,(5.63±1.07)%,(5.57±0.98)%。與CO組相比,MO組CVF值明顯升高(P<0.05);與MO組相比,其他藥物干預組CVF值明顯降低(F=203.700,P<0.05),各亞麻油治療組間CVF值隨亞麻油治療劑量增加而降低(P<0.05),LH組和CA組CVF值降低最明顯,組間比較差異無統計學意義(t=0.124,P=0.902)。詳見圖3。

MO組與CO組比較,＊ P<0.05;與MO組比較,#P<0.05;與LL組比較,△ P<0.05;與LM組比較,※ P<0.05。

2.4 各組大鼠心肌組織中HIF-1α、CTGF mRNA表達比較 與CO組相比,MO組大鼠心肌組織中CTGF mRNA表達增加,HIF-1α mRNA表達下降(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組HIF-1α mRNA表達增加,CTGF mRNA表達降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組HIF-1α mRNA表達增加,CTGF mRNA表達降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組HIF-1α mRNA表達增加,CTGF mRNA表達降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織HIF-1α、CTGF mRNA表達比較

2.5 各組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達比較 與CO組相比,MO組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB、TNF-α、NF-κBp65蛋白表達比較

3 討 論

急性心肌梗死是心血管疾病死亡的主要原因之一,我國急性心肌梗死的發病率不斷升高,死亡率也呈整體上升趨勢,高額的醫藥費用造成嚴重的經濟負擔,同時也影響人們的生活質量[10-11]。在心肌梗死發生后,缺血心肌釋放的細胞因子通過各種信號通路被激活,引起心肌細胞和成纖維細胞的過度增殖及細胞外基質的沉積,最終誘發心肌炎癥反應、心肌纖維化及心功能障礙,因此,抑制炎癥反應可以減輕心臟纖維化程度及心肌損傷。有研究發現,亞麻油對冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化造成的血管狹窄和堵塞所引起的心肌缺氧、壞死的心臟病有一定治療作用[12]。因此,本研究基于NF-κB通路探究亞麻油干預心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機制。

本研究發現,經過亞麻油干預后,NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達降低,說明亞麻油對心肌梗死大鼠纖維化有保護作用,可以抑制炎癥反應,防止斑塊的形成、破裂,對心肌細胞損傷有一定的保護作用?？ㄍ衅绽茏饔糜谛呐K的腎素-血管緊張素系統,阻斷血管緊張素Ⅱ并下調轉化生長因子β,從而抑制心肌梗死后的膠原增生,改善心肌纖維化。但是卡托普利有較多的不良反應,可引起心悸、蛋白尿、味覺遲鈍等。亞麻油對人體健康有益,具有增強人體免疫力、預防癌癥等多種功效[13]。近年來,心血管疾病的危險因素研究中炎性因子引起眾多學者的關注,NF-κB廣泛存在于包括心肌細胞、血管內皮細胞在內的各種細胞中,具有基因轉錄多向調控作用。急性心肌梗死發生時氧化應激可誘導NF-κB激活,活化的NF-κB經細胞外的正反饋途徑,增強TNF-α基因轉錄,使TNF-α產生和釋放增多,而TNF-α作為NF-κB激活劑,再次激活NF-κB,導致最初的炎癥信號進一步放大[14]。TNF-α是一種具有多種生物學效應的細胞因子,TNF-α通過促進基質蛋白溶解,抑制血管平滑肌細胞的膠原蛋白基因表達和膠原合成參與斑塊形成和破裂,從而促進心肌梗死的發生發展和并發癥的發生。

孫治霞等[15]通過對心肌梗死大鼠的研究發現,心肌梗死后NF-κB信號通路相關炎性因子TNF-α、NF-κB表達增加,NF-κB DNA結合活性增加,提示心肌梗死后NF-κB通路被激活,同時TNF-α、NF-κB表達降低,可以防止心肌細胞的損傷,抑制心肌梗死大鼠心肌纖維化。已有研究表明,亞麻油中α-亞麻酸對血栓的形成有一定的抑制作用,能夠改變血液流動性,預防心腦血管疾病,同時亞麻油中的亞麻籽蛋白可以保護心臟[16]。Ni等[17]研究發現,亞麻油可以增強免疫力,同時亞麻油中α-亞麻酸可調節子宮內膜異位癥小鼠模型的腸道微生物群,降低脂多糖引起的局部炎癥,有較好的抗炎作用。

本研究發現,MO組大鼠LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高,說明心肌梗死大鼠心臟舒張功能受損。經過亞麻油干預后LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低,說明亞麻油可改善大鼠心臟的收縮和舒張功能,減輕心肌纖維化損傷,保護心肌。HE染色顯示,MO組大鼠心肌細胞結構疏松且有斷裂、排列紊亂、炎性細胞增多,有明顯出血壞死。Masson 染色可見MO組大鼠大片藍色的心肌膠原沉積于心肌細胞及血管周圍;MO組大鼠心肌纖維化指標CVF較CO組顯著升高,說明MO組心肌纖維化嚴重、心肌肥厚顯著。經過亞麻油干預后發現,亞麻油可以增加心室壁的順應性,改善大鼠心功能,抑制心室重構,逆轉心肌纖維化。亞麻油具有抑制心臟成纖維細胞DNA的合成,從而減輕膠原增生,抑制心肌纖維化作用。有研究表明,亞麻油在預防冠心病、糖尿病、結腸癌和減重等方面有一定的效果[18]。本研究發現,經亞麻油干預后,HIF-1α mRNA表達增加、CTGF mRNA表達降低,說明大鼠心功能得到了改善,亞麻油可提高HIF-1α的表達,降低CTGF的表達,從而對心肌梗死大鼠心肌纖維化起到抑制作用。有研究認為,引起心肌纖維化的主要機制是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活,該系統中的關鍵活性成分為血管緊張素Ⅱ,其可以激活和促進一系列生長因子(如TNF-α、CTGF等)表達,最終引起細胞外基質的大量積聚,導致纖維化的發生。HIF-1α是在低氧條件下產生的一種內源性關鍵的氧敏感轉錄因子,在生理和病理條件下調控多種基因表達,從而發揮機體對低氧或缺血的保護性適應。CTGF是與各種器官組織纖維化過程密切相關的細胞因子.能促進成纖維細胞增殖,促進細胞外基質合成。有研究發現,HIF-1α可以降低炎性因子的表達,并且其作用機制和抑制NF-κB通路有關。HIF-1α活化后能夠降低心肌酶活性,改善心肌組織形態,抑制心肌細胞凋亡,降低心肌梗死面積,從而改善心肌梗死后心肌纖維化損傷[19]。Parikh等[20]通過對心肌梗死大鼠進行研究,發現經過亞麻油干預后,大鼠心律失常的發生率降低,心肌纖維化及TNF-α表達降低,說明亞麻油可以預防和治療心肌梗死后的心律失常,同時還能保護心肌,與本研究結果一致。

綜上所述,亞麻油可以抑制大鼠心肌纖維化,改善心功能,對心肌梗死大鼠心肌起保護作用,其作用機制可能與調控NF-κB相關信號通路有關。