青蒿琥酯對糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纖維化的影響

楊 萍,代 天,劉 波,鄒 勇,趙 謙,張蘇川

糖尿病是一種高發的疾病,病人血糖濃度長期處于高水平,引發膠原纖維過度積累,造成多種組織器官纖維化變性,其中心肌纖維化是糖尿病病人常見的并發癥,可嚴重損傷心臟的收縮、舒張功能,導致心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等心臟疾病,是晚期糖尿病病人死亡的主要原因[1-2]。高糖環境可引發機體嚴重的炎癥反應,促使心肌細胞凋亡,進而導致心肌組織膠原沉積,引發心肌纖維化[3-4]。絲裂原細胞外信號調節激酶(MEK)/細胞外信號調節激酶(ERK)通路在心肌梗死病理過程中發揮著重要調控作用,降低MEK、ERK磷酸化水平,可起到抗炎、抗氧化作用,減輕心肌組織炎癥損傷,抑制成纖維細胞分化,緩解心肌纖維化,修復心功能,由此可知MEK/ERK信號通路是改善心肌纖維化的主要治療靶點[5-6]。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物,具有抗瘧疾、抗炎、調節免疫等廣泛的生物學作用,可降低促炎因子表達,減輕糖尿病大鼠腎組織炎癥損傷,還可抑制其視網膜病變[7-8]。本研究觀察青蒿琥酯對糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠[生產許可證號:SCXK(滬)2017-0004,購自上海茂生衍生物科技有限公司],雌雄各半,體質量200～240 g,飼養在溫度25 ℃、相對濕度55%的本院動物房中,將室內環境維持在清潔級,并保持安靜、通風良好,自然照明,大鼠自由進食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器 青蒿琥酯購自上海寶曼生物科技有限公司[高效液相色譜(HPLC)≥98%,貨號D1085];鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(規格:每片0.5 g,國藥準字H20023370);鏈脲佐菌素購自西安熱默爾生物科技有限公司(純度99%,貨號0210055701);Masson染色試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司(貨號XY-4422-1);大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號YS06433B);大鼠肌鈣蛋白I(cTnI)ELISA試劑盒購自廈門侖昌碩生物科技有限公司(貨號LCS34521);大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、兔源磷酸化MEK(p-MEK)一抗、兔源MEK一抗、兔源ERK一抗、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗及兔源p-ERK一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司(貨號分別為ab5603、ab100772、ab96379、ab178876、ab32537、ab1194、ab192591、ab150077);BCA試劑盒購自上海碧云天公司(貨號P0011);RIPA裂解液購自南京森貝伽生物科技有限公司(貨號BI-WB012)等。XElx800酶標儀購自Perkin Elmer公司(美國);BX-4000全自動生化分析儀購自南京新惠通生物科技有限公司(中國);RM2235病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司(中國);ECLIPSE CI正置光學顯微鏡購自NIKON公司(日本);Trans-Blot Turbo快速轉膜儀、1659001蛋白電泳儀均購自Bio-Rad公司(美國);GIS-500凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司(中國)等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 糖尿病模型大鼠參考文獻[9]中方法制備,以60 mg/kg的鏈脲佐菌素溶液腹腔注射,72 h后測量血糖含量至少2次,均高于16.7 mmol/L表明模型建立成功,建模65只,共成功60只,隨機分為模型組、青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組,每組12只。另取12只SD大鼠設為對照組,腹腔注射等劑量生理鹽水。

將青蒿琥酯溶于生理鹽水,獲得2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的溶液[10],將二甲雙胍片粉碎溶于生理鹽水中,制備成7 mg/mL的溶液[11]。藥物處理組給藥劑量均為10 mL/kg,給藥方式為灌胃,對照組與模型組大鼠灌胃等劑量生理鹽水,每日1次,持續14 d。

1.3.2 血糖、總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)檢測及標本收集 給藥結束24 h后,以5 mL注射器經尾靜脈取血4 mL,取其中2 mL,4 ℃環境下以3 000 r/min速率離心15 min,收集上清液于-80 ℃冰箱中儲存備用,剩余血液用于全自動生化分析儀檢測血糖、TC和TG水平。以乙醚麻醉大鼠后斷頭處死,解剖得到心臟,剪取約0.5 g心肌組織,剪碎,加入RIPA裂解液,冰水浴中勻漿制備為勻漿液,4 ℃環境下以3 000 r/min速率離心20 min,收集血清,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度后調整至相同,具體操作參照試劑盒說明書步驟進行,儲存在液氮中備用;剩余心肌組織采用4%多聚甲醛溶液固定處理,然后依次經80%、90%、100%的乙醇溶液脫水,再以二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切片,得到連續病理切片備用,厚度為2 μm。

1.3.3 大鼠心肌組織纖維化情況檢測 將切片做脫蠟處理后,依次經100%、90%、80%的乙醇溶液浸泡,采用Masson試劑盒進行染色,具體步驟參照說明書進行,再次經脫水、透明后封片,在光學顯微鏡下觀察心肌組織纖維化情況,任選5個視野采集圖像。

1.3.4 血清CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平檢測 將血清標本置于4 ℃冰箱中解凍,采用ELISA法檢測CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平,具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.5 大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達檢測 將心肌組織蛋白樣品液置于冰水浴中緩慢解凍,每組各取20 μL上樣,恒壓110 V下電泳分離蛋白,恒壓110 V下濕轉,轉移蛋白到聚偏二氟乙烯膜(PVDF),于5%脫脂奶粉溶液中室溫下封閉2 h,然后以兔源GAPDH、MEK、p-MEK、ERK及磷酸化ERK(p-ERK)一抗溶液在4 ℃冰箱中孵育過夜,抗體稀釋比例均為1∶2 000,TBST溶液漂洗3次,再置于稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗溶液中,室溫孵育2 h,TBST溶液漂洗3次,經增強化學發光法顯色后以凝膠成像儀拍照,采用Quantity One軟件對所得圖片進行分析,測定各蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組血糖、TC、TG水平比較 與對照組比較,模型組血糖、TC、TG水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組血糖、TC、TG水平降低,且青蒿琥酯各劑量組呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組血糖、TC、TG水平比較 單位:mmol/L

2.2 各組大鼠心肌纖維化情況比較 與對照組比較,模型組大鼠心肌組織膠原纖維增多,呈現明顯纖維化變性。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組心肌組織膠原纖維減少,纖維化變性減輕,且隨著青蒿琥酯劑量升高而逐漸減輕,青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,纖維化變性程度無明顯差異。詳見圖1。

圖1 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化情況(×400)

2.3 各組血清CK-MB、cTnI水平比較 與對照組比較,模型組大鼠血清CK-MB、cTnI水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組大鼠血清CK-MB、cTnI水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組血清CK-MB、cTnI水平比較

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 與對照組比較,模型組血清TNF-α、IL-6水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組血清IL-6、TNF-α水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 單位:pg/mL

2.5 各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達比較 與對照組比較,模型組心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達

表4 各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白相對表達量比較

3 討 論

我國糖尿病病人眾多,數量居全球首位,且近年來發病率逐漸上升,嚴重影響人民身心健康,防控形勢十分嚴峻,糖尿病心肌病是糖尿病病人的一種常見并發癥,心肌間質纖維化是其主要病理特征[12-13],高血糖可使活性氧、促炎細胞因子大量合成與釋放,引發嚴重炎癥反應,導致細胞外基質和膠原纖維沉積,是糖尿病心肌病的主要致病機制[14-15]。心肌細胞凋亡時,CK-MB、cTnI可大量釋放入血,使血清中含量升高,可作為心肌損傷的標志物[16]。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素溶液構建糖尿病大鼠模型,結果顯示建模大鼠心肌組織膠原纖維增多,呈現明顯纖維化變性,大鼠血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平明顯升高,表明鏈脲佐菌素可導致大鼠糖脂代謝紊亂,升高血糖、血脂水平,促使炎性因子TNF-α、IL-6大量合成與釋放,造成心肌組織炎癥損傷,引發心肌纖維化變性,表明模型建立成功。

青蒿琥酯作為青蒿素的一種衍生物,可清除活性氧自由基,降低促炎因子合成釋放,抑制炎癥反應發生發展,促使糖尿病病人皮膚傷口愈合,還能通過增強自噬作用抑制腎組織纖維化,保護糖尿病大鼠腎功能[17-18],但青蒿琥酯對糖尿病心肌纖維化的影響目前還未見報道。本研究結果顯示,糖尿病模型大鼠經不同劑量青蒿琥酯處理后心肌組織纖維化程度減輕,且纖維化程度隨劑量升高而逐漸遞減,血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,表明青蒿琥酯可改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂,降低血糖、血脂及促炎因子水平,抑制炎癥反應,減輕心肌損傷,減緩心肌纖維化進程,且隨青蒿琥酯劑量升高而作用增強。

MEK/ERK是機體介導炎癥反應的主要信號通路,研究發現,在心肌損傷及心肌纖維化過程中,該信號處于激活狀態,降低其通路相關蛋白MEK、ERK磷酸化水平,可抑制心肌梗死大鼠炎癥反應,改善纖維化病變,修復心功能[19-20],因而MEK/ERK信號通路可能作為糖尿病心肌纖維化的潛在治療靶點。本研究結果顯示,糖尿病模型大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明顯升高,以不同劑量的青蒿琥酯處理后,其心肌組織蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,表明青蒿琥酯可降低MEK/ERK通路蛋白磷酸化水平,抑制心肌炎癥反應,減輕心肌纖維化變性。

綜上所述,青蒿琥酯可減弱MEK、ERK磷酸化,降低促炎因子水平,阻止炎癥發生發展,改善糖尿病大鼠糖脂代謝,減輕心肌炎癥損傷,緩解心肌纖維化變性,為糖尿病心肌病的臨床治療提供了新的參考,抑制MEK/ERK通路可能是其藥理機制之一,后續研究需以MEK/ERK通路激動劑及抑制劑來進行對照驗證,進而對其藥理機制進行更全面的闡釋。