蔥白提取物干預脂多糖誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷的實驗研究

陳榮榮,張 茜

膿毒癥心肌病是臨床上膿毒癥最常見的并發癥之一,炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙及心肌細胞凋亡參與了膿毒癥心肌損傷的發生;闡明心肌細胞損傷的機制,從而改善膿毒癥病人心肌損傷狀況,對臨床治療膿毒癥具有重要意義[1-2]。研究表明,中醫藥在治療膿毒癥方面效果明顯[3]。蔥白為百合科植物蔥近根部的鱗莖,是臨床常用的中藥,其主要化學活性成分為甾體及皂苷類化合物、黃酮類、揮發油類等,具有心臟保護、抗血栓、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用,可以治療心腦血管疾病[4]。有研究報道,蔥白提取物可抑制心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌纖維化[5];蔥白提取物可通過抑制炎癥反應與抗氧化損傷抗大鼠急性心肌缺血[6];蔥白提取物可明顯降低大鼠血清丙二醛(MDA),升高超氧化物歧化酶(SOD)及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)水平,對缺血心肌具有保護作用[7]。以上研究表明,蔥白提取物具有抗氧化作用,且可抗心肌缺血。然而蔥白提取物對脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷的影響及機制尚不清楚。有研究報道,敲減miR-194-5p可抑制LPS誘導的心肌細胞炎性因子的分泌,可為心血管損傷的治療提供新靶點[8]。因此,本實驗旨在觀察蔥白提取物對LPS誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2細胞(美國ATCC);DMEM培養基(美國Hyclone);LPS(美國Sigma);蔥白提取物(西安金綠生物工程技術有限公司);細胞毒性試驗(CCK-8)試劑盒、蛋白提取試劑盒、凋亡檢測試劑盒均購自上海吉至生化科技有限公司;MDA含量檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒和過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司;熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒購自上海科敏生物科技有限公司。

1.2 CCK-8法檢測LPS對H9c2細胞活性的影響 H9c2細胞用DMEM培養基培養,取對數生長期細胞,分別用1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS處理,在5%體積分數CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養48 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑繼續培養2 h,酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值(A)。后續試驗選擇細胞活性約為50%的LPS濃度。

1.3 細胞處理與分組 常規培養的H9c2細胞作為NC組,單獨用LPS 10 μg/mL處理的H9c2細胞作為LPS組,分別用25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL蔥白提取物和LPS 10 μg/mL處理的H9c2細胞作為蔥白提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組;將miR-194-5p抑制劑及陰性對照轉染至H9c2細胞后用10 μg/mL的LPS處理,作為anti-miR-194-5p+LPS組、anti-miR-NC+LPS組;將miR-194-5p模擬物及陰性對照轉染至H9c2細胞后用100 mg/mL蔥白提取物和10 μg/mL的LPS處理,作為miR-194-5p+蔥白提取物高劑量+LPS組、miR-NC+蔥白提取物高劑量+LPS組。

1.4 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達 提取各組H9c2細胞的總蛋白,定量變性后取50 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后轉膜、封閉,分別加入Cleaved-Caspase-3和Bax一抗(1∶800),4 ℃孵育過夜;洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,顯影、成像后分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內參。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取各組培養48 h的細胞,加入胰酶消化后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗細胞2次,加入結合緩沖液輕搖使之形成均勻細胞懸液,分別加V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)各5 μL,輕搖混勻,常溫避光孵育15 min,上流式細胞儀檢測。

1.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞中MDA含量及SOD、CAT活性 細胞培養48 h后收集各組細胞,分別按各自試劑盒說明書進行操作。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-194-5p表達水平 提取各組H9c2細胞總RNA,合成cDNA后以U6為內參進行PCR擴增,相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-194-5p正向引物序列為5′-GCCGTGTAACAGCAACTCCA-3′,反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6正向引物序列為5′-GTGGACCGCACAAGCTCGCT-3′,反向引物序列為5′-TTGTTGAACGGCACTGTGTATAGCA-3′。

2 結 果

2.1 不同濃度LPS對H9c2細胞活性的影響 與0 μg/mL的LPS比較,1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS處理后H9c2細胞活性明顯降低(P<0.05)。詳見表1。選擇細胞活力為50%左右的LPS濃度(10 μg/mL)用于后續試驗。

表1 不同濃度LPS對H9c2細胞活性的影響

2.2 不同濃度蔥白提取物對LPS誘導的H9c2細胞凋亡及蛋白表達的影響 與NC組比較,LPS組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達水平和H9c2細胞凋亡率升高(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達水平和H9c2細胞凋亡率降低(P<0.05)。詳見圖1、圖2及表2。

圖1 流式細胞儀檢測各組H9c2細胞凋亡

圖2 Western Blot檢測各組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達

表2 各組H9c2細胞凋亡率及Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達水平比較

2.3 不同濃度蔥白提取物對LPS誘導的H9c2細胞氧化應激損傷的影響 與NC組比較,LPS組MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組氧化應激指標MDA、SOD、CAT比較

2.4 不同濃度蔥白提取物對LPS誘導的H9c2細胞中miR-194-5p表達水平的影響 與NC組比較,LPS組miR-194-5p表達水平升高(P<0.05);與LPS組比較,蔥白提取物低、中、高劑量組miR-194-5p表達水平降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組LPS誘導的H9c2細胞中miR-194-5p表達水平比較

2.5 anti-miR-194-5p對LPS誘導的H9c2細胞凋亡、蛋白表達和氧化應激損傷的影響 與anti-miR-NC+LPS組比較,anti-miR-194-5p+LPS組miR-194-5p表達水平降低,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達水平和細胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見圖3、圖4及表5。

圖3 流式細胞儀檢測H9c2細胞凋亡

圖4 Western Blot檢測Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達

表5 anti-miR-194-5p對LPS誘導的H9c2細胞凋亡蛋白表達和氧化應激損傷的影響

2.6 miR-194-5p逆轉蔥白提取物對LPS誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激損傷的影響 與miR-NC+蔥白提取物高劑量+LPS組比較,miR-194-5p+蔥白提取物高劑量+LPS組miR-194-5p表達水平升高,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達水平和細胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見表6及圖5、圖6。

圖5 流式細胞儀檢測H9c2細胞凋亡

圖6 Western Blot檢測Cleaved-Caspase-3蛋白表達

表6 miR-194-5p逆轉蔥白提取物對LPS誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激損傷的影響

3 討 論

膿毒癥心肌病的發生是膿毒癥病人預后不良的預測因素之一,氧化應激是膿毒癥多臟器,多系統損傷的根本機制,參與了心肌損害的發病過程,抗氧化劑可能成為膿毒癥治療的新策略[9-11]。有研究表明,蔥白提取物可通過提高硫化氫(H2S)和一氧化氮(NO)水平抗大鼠急性心肌缺血[12]。蔥白提取物通過線粒體途徑減少心肌細胞凋亡從而對心肌缺血再灌注損傷起保護作用[13]。蔥白提取物可降低急性心肌缺血兔血清中MDA水平,升高SOD水平[14]。本實驗用不同濃度LPS處理心肌細胞,選擇細胞活力為50%左右的LPS濃度(10 μg/mL)用于后續試驗,建立細胞損傷模型;LPS誘導的心肌細胞H9c2的凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。而用不同濃度蔥白提取物預處理后,H9c2細胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高。表明蔥白提取物可抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激反應。本實驗結果表明,蔥白提取物在LPS誘導的心肌細胞中同樣具有抗凋亡和抗氧化應激損傷的作用。

研究報道,敲除lncRNA MALAT1可通過miR-194-5p/FOXP2軸抑制細胞凋亡從而減輕LPS誘導的急性肺損傷[15]。circ-USP1通過調節miR-194-5p/DNMT3A軸保護腎小管免受缺氧誘導的腎損傷[16]。且已有研究報道敲減miR-194-5p可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥反應[8]。本實驗結果顯示,LPS誘導的心肌細胞中miR-194-5p表達水平升高;抑制miR-194-5p表達后,細胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,表明抑制miR-194-5p表達可抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激。

此外,本實驗還發現蔥白提取物處理可降低miR-194-5p表達水平;過表達miR-194-5p和高劑量蔥白提取物處理后,心肌細胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。說明miR-194-5p過表達逆轉了蔥白提取物對LPS誘導的H9c2凋亡和氧化應激損傷的影響。

綜上所述,蔥白提取物通過下調miR-194-5p抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷。