基于網絡藥理學探討桂枝生姜枳實湯治療冠心病不穩定型心絞痛的作用機制

姜家錚 姚昆鵬 龍 云

1.湖南中醫藥大學，湖南長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙 410007

冠心病不穩定型心絞痛（unstable angina，UA）是我國常見心血管疾病，截至2020 年，我國累計冠心病患者1139 萬[1]，城鄉居民冠心病病死率分別為120.18/10 萬和128.24/10 萬[2]。UA 為冠狀動脈硬化、脂質沉積長期發展的結果[3-4]，常具有不可逆性，西藥治療予以調脂穩斑、抗血小板聚集、改善心肌血供、減輕心肌氧耗等[5]。然而，患者依從性差、經濟負擔重等因素，在一定程度上限制了UA 的西醫治療。中醫藥治療UA 效優價廉，無論依從性及經濟角度，都具有較大優勢。

桂枝生姜枳實湯系東漢張仲景于《金匱要略》中所載，“心中痞，諸逆，心懸痛，桂枝生姜枳實湯主之[6]”。此方溫陽化飲，下氣降逆，臨床多用于痰飲所致心胃陽氣不足之冠心病、心絞痛等[7]，然作用機制尚待進一步研究。

網絡藥理學方法將現有生物信息學數據庫與計算機技術結合，獲取實用的醫學信息[8-9]。通過明確上下游靶點來闡釋生物學過程，對于探索中醫遣方用藥規律具有重大作用，尤其適合中藥復方的研究[10-11]。2021 年世界中醫藥學會聯合會發布的《網絡藥理學評價方法指南》[12]起到進一步的指導作用[13]。本研究擬使用網絡藥理學的方法，探討桂枝生姜枳實湯治療UA 的作用機制，以期為今后的體內、外實驗及相關藥效學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選和作用靶點的預測

通過TCMSP 數據庫檢索桂枝生姜枳實湯的藥物成分及作用靶點，條件設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，設置類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，所得靶點通過UniProt 數據庫規范為標準化基因名。

1.2 獲取疾病相關靶點

以關鍵詞“unstable angina”在GeneCards、PharmGkb、DrugBank 數據庫中檢索UA 的疾病靶點。再設置篩選條件“Relevance Score ≥1”，將獲取的疾病靶點作進一步篩濾。

1.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

通過Perl 軟件來比對以上藥物作用靶點與疾病靶點，獲得藥物-疾病核心作用基因。進而使用Cytoscape 3.8.0 軟件建立中藥成分-靶點的網絡圖譜。

1.4 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡及拓撲分析

利用STRING 平臺建立交集靶點PPI 網絡，獲得桂枝生姜枳實湯治療UA 的關鍵基因。再通過Cytoscape 3.8.0 軟件進行拓撲分析。

1.5 基因功能富集與通路富集分析

利用R 語言軟件對藥物-UA 疾病交集靶基因進行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）富集分析，涵蓋其生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF），找到差異最顯著的生物學通路，并將結果進行可視化。

2 結果

2.1 有效成分篩選以及作用靶標預測

桂枝生姜枳實湯的藥物成分共檢索到34 種，其中桂枝7 種，生姜5 種，枳實22 種。經靶標預測確定靶點139 個。

2.2 獲取UA的疾病靶點

檢索上述疾病數據庫并篩選去重后可得UA 疾病靶共899 個。將藥物靶點與疾病靶點比對，獲得77 個交集靶點。見圖1。

圖1 疾病靶點與藥物靶點交集Venn 圖

2.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

基于Cytoscape 3.8.0 軟件平臺，將交集靶點進行整合，繪制“藥物-成分-靶點”圖，見圖2。共有相關靶點104 個，相互關系231 種。枳實中有效成分對應靶點最多，其中木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陳皮素（nobiletin）分別與35、23、23 個靶點相關。有效成分中對應靶點數最多的是PTSG2 基因（24 個），其次PTGS1 基因（17 個）和HSP90AA1 基因（17 個）。

圖2 桂枝生姜枳實湯干預UA 的藥物-成分-靶點圖

2.4 構建PPI網絡與拓撲分析

將交集靶點導入STRING 平臺及Cytoscape 3.8.0軟件，構建PPI 網絡并可視化，見圖3，共計靶點63 個，相互關系185 種。利用CytoNCA 插件拓撲分析，共獲得核心基因6 個，按DC 排序為TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN，見圖4。

圖3 桂枝生姜枳實湯治療UA 主要靶點的PPI 網絡圖

圖4 交集基因拓撲分析

2.5 GO/KEGG分析

將交集基因富集分析，得到GO 條目2085 個，其中BP 1917 個，CC 67 個，MF 101 個，選前10 建立柱狀圖（圖5A）；得到KEGG 通路152 條，選前30 建立氣泡圖（圖5B）。在GO 富集中發現活性氧代謝過程、氧化應激反應、膜筏+膜微結構域、泛素樣蛋白連接酶結合、轉錄因子活性等生物過程在桂枝生姜枳實湯治療UA 過程中起到關鍵作用。在KEGG 富集分析中發現，與UA 相關的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 信號通路等。見圖5B。

圖5 桂枝生姜枳實湯潛在靶點的富集分析

3 討論

冠心病不穩定型心絞痛為西醫病名，系冠狀動脈粥樣硬化致血管腔狹窄/痙攣，心臟供血供氧不足，進而心肌缺血的一類疾病。傳統中醫無此病名，根據其發病癥狀多歸為“胸痹心痛”。陽虛寒凝、血瘀痰濁被認為是UA 的主要證型[14]。張仲景在《金匱要略》有云：“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責其極虛也。”點明胸痹心痛病機為陽微陰弦，宜從溫陽立法。桂枝生姜枳實湯為溫陽法的代表，桂枝溫通心陽，生姜發越水氣，枳實除痞下氣，共奏通陽化飲，降逆理氣之功。

本研究發現，枳實中有效成分對應靶點最多，其中木犀草素、柚皮素、川陳皮素可能是桂枝生姜枳實湯治療UA 的核心成分。木犀草素可抑制炎癥、抗氧化應激，對冠心病、高血壓等多種心血管疾病具有防治作用，其機制與激活PI3K/Akt、TLR-4/NF-κB 信號通路，調節p53 等下游靶蛋白的表達密切相關[15]。此外，木犀草素可活化PI3K/Akt/mTOR 信號通路，改善心功能，抑制心室重構[16]。線粒體功能障礙是心肌缺血再灌注（MI/R）誘導心肌細胞凋亡中的關鍵一環，改善線粒體損傷對治療UA 意義重大。柚皮素可直接抑制線粒體氧化應激損傷并保持線粒體功能，從而減輕MI/R 損傷，AMPK-SIRT3 信號在此過程中發揮關鍵作用[17]。川陳皮素具有抗血栓、抗血凝、抗炎、抗膽堿酯酶等作用[18]，可通過激活PI3K/Akt 信號通路，發揮抗心肌細胞損傷的作用，減少大鼠心肌細胞凋亡，在心血管領域有較好的應用前景[19]。

目前對UA 的研究集中在降低血脂水平，改善缺氧所致的氧化應激、血管內皮損傷等。本研究GO 富集結果顯示，桂枝生姜枳實湯干預UA 主要通過兩方面，一為調節氧代謝，改善氧化應激；二為調節細胞膜的通透性，促進轉錄因子的結合。這與目前已知的UA 發病機制相對應。KEGG 富集分析提示參與桂枝生姜枳實湯干預UA 的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等，均為經典的炎癥/氧化應激/細胞凋亡相關通路，表明桂枝生姜枳實湯可能由此發揮抗心絞痛作用。

目前尚無關于桂枝生姜知枳實湯的有效成分、靶點和機制的報道。本研究通過網絡藥理學分析，桂枝生姜枳實湯可能通過激活PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等信號通路，調節TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN 等下游靶基因，改善缺氧所致心肌損傷，達到治療UA 的作用。然而本研究尚有一定的局限性，如數據庫收錄的數據有限，中藥成分研究尚不完整，以及缺乏相關體外細胞實驗支持等，因此需要進一步的實驗驗證。