女子柔道運動員尿液代謝組學代謝物特點研究

趙麗霞，劉月濤，朱彥蓉，邵 彤

機體代謝組學從整體角度對生物體系統進行綜合研究，以反映個體的生命狀況。代謝組學在競技體育中作為運動人體科學研究的新工具，在研究運動性疲勞和運動訓練的生理生化方面具有很大優勢（黃彩華 等，2011）。運動對機體代謝組學的影響是近幾年研究的主要內容。運動人體科學工作者從機體尿液代謝組學以及血清代謝組學的角度，探究不同運動項目、運動狀態、運動營養補充后機體的反應情況。運動量表從心理測量角度反映運動員的運動訓練狀態。通過運動訓練狀況監測量表所建立的過度訓練模型，可以反映出運動負荷對運動員的影響，以進一步評價運動負荷。

基于此，本研究運用代謝組學方法對運動員尿液代謝組學特征進行分析，以了解女子柔道運動員機體物質代謝特征，由此反映出運動員的機能狀態和運動員的代謝狀況。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

以山西女子柔道隊18 名女子柔道運動員為研究對象，對運動員日常訓練期間晨尿的代謝組學代謝物進行研究。將運動員按照1～18 編號。同時向運動員發放《運動員訓練狀態監測量表》（晏寧，2003），以反映運動員訓練期間的心理狀態和疲勞狀態。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與材料

儀器：Bruker 600-MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer（600.13 MHz 質子頻率，德國布魯克公司600 兆核磁儀），TGL 高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），SC-3610 低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），XK80-A 快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）。

材料：重水D2O（Norell，Landisville，USA），磷酸緩沖溶液（磷酸氫二鉀K2HPO4和磷酸二氫鈉NaH2PO4，pH=7.4，含TSP 0.01%），三甲基硅烷丙酸鈉鹽（TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA），氫氧化鈉（NaOH）等。

1.2.2 實驗方法

留取18 名女子柔道運動員的晨尿并存放在尿液采集試管中，收集試管并編號后以冰袋冷藏，之后立即轉運至測量中心。將尿液樣品以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，儲存于-80 ℃保存（每份不少于1 mL）。

將尿液樣品緩慢解凍，使用移液槍精密吸取500 μL 加入EP 管中，加入200 μL 磷酸緩沖溶液，渦旋30 s，于4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，取上清液600 μL 移至5 mm 核磁管中待測。采用noesyppr1d 脈沖序列，以壓制殘余水信號，內標為TSP。樣品在25 ℃下使用Bruker 600-MHz AvanceⅢ NMR Spectrometer 進行核磁圖譜分析，測定頻率為600.13 MHz，掃描次數為64，譜寬為12 345.679 Hz，脈沖時間為14.0 μs，采樣時間為2.654 s，延遲時間為1.000 s，采樣間隔為40.5 μs。

尿液核磁圖譜采用MestReNova 6.1.0 進行處理，對所有1H 核磁共振波譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）圖譜進行手動相位和基線調整。所有圖譜以TSP（δ 0.00）為標準，對譜圖進行化學位移的校正，調整相位、基線，以δ 0.01 對化學位移區間進行分段積分，其中δ 4.60～5.20（殘余水峰）不進行積分，剩余的信號積分值進行歸一化并將積分數據導入Excel 表格中，以待作進一步的統計分析。

1.2.3 數據處理

運用SIMCA-P 13.0（Umetrics，瑞典）軟件將積分數據進行多元統計分析。首先采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法對樣本內部固有的差異性和相似性進行分析，然后采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），以獲得更好的樣本分類效果。

將進行1H NMR 尿液代謝組學測取的代謝物峰面積數據導入SPSS 21.0 統計軟件中，運用方差分析方法進行統計分析。

1.2.4 運動訓練心理狀態的監測

實驗以晏寧（2003）為監測運動員過度訓練而研制的心理量表為依據，其設計的《運動員訓練狀態監測量表》包括45 個題目、7 個選項，包含8 個分量表，分別為情緒應激、感覺良好、疲勞、自我效能、自我調節、體能恢復、心理耗竭、心理疲勞（張力為 等，2010）。將該量表發放給運動員進行測量。分量表條目相加后的得分即為分量表得分。將該得分導入SPSS 21.0 統計軟件，采用方差分析方法即可對數據進行統計分析。

2 研究結果

2.1 對女子柔道運動員尿液代謝組學的分析

2.1.1 基于1H NMR的尿液代謝組學數據分析

采用1H NMR代謝組學技術對18個尿液樣本的1H NMR圖譜進行對比分析（圖1）。

圖1 基于1H NMR的尿液代謝組學圖譜Figure 1.1H NMR-Based Map of Urinary Metabonomics

通過化學位移、耦合常數及峰型等數據分析，結合公共數據庫HMDB（http：//www.Hmdb.ca/）、BMRB（http：//bmrb.Wisc.edu/）對圖譜中主要化合物進行歸屬，尿液中共指認24 種化合物，主要包含有機酸、氨基酸以及含氮小分子等成分（表1）。

表1 基于1H NMR的尿液代謝組學指認的特征代謝物Table 1 Characteristic Metabolites Identified by 1H NMR-Based Urinary Metabolomics

2.1.2 對尿液代謝組學代謝物1H NMR 積分數據的多元統計分析

為直觀分析樣本之間的差異，采用PCA 散點圖觀察樣本的分離趨勢，可以看出樣本之間明顯分離的狀況。除2 號樣本外，其余17 個樣本都具有聚類特征，可分為3 個組別（A 組、B 組、C 組）。采用PLS-DA 分析，得到除2 號樣本外的其余17 名運動員尿液代謝組學樣本的得分圖，發現17 名運動員的尿液代謝組學樣本存在明顯區分（圖2）。根據圖2，可將17 名運動員分為3 個組別，即編號為6、7、8、9 的運動員為A 組，編號為10、11、12、13、14、16、18 的運動員為B 組，編號為1、3、4、5、15、17 的運動員為C 組。

圖2 PLS-DA分析得分圖Figure 2.Score Plot of PLS-DA Analysis

2.2 不同組別女子柔道運動員代謝物特征與運動訓練狀態監測評定

2.2.1 運動員尿液代謝組學1H NMR指認代謝物的差異性

據尿液代謝組學代謝物1H NMR 積分數據的多元統計分析的分組情況，對各組中每位運動員所指認的24 種代謝物的峰面積值進行單因素方差分析，兩兩比較組間的差異性。統計分析表明，部分組間代謝物峰面積值存在顯著差異性（P＜0.05；表2）。

表2 3個組別間具有統計學意義的尿液代謝組學代謝物峰面積值比較Table 2 Comparison of Instatistically Significant Peak Area Value of Urinary Metabolomics in the Three Groups

代謝物纈氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、膽堿峰面積值在A組與B 組間、A 組與C 組間存在差異性（表2）。由均值差可見，A 組的纈氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、膽堿峰面積值較B 組、C 組更高。?；撬岱迕娣e值在A 組與B 組間、B 組與C 組間存在差異性。由均值差可見，B 組的?；撬岱迕娣e值較A、C 組更高。此外，在A 組與C 組間，代謝物檸檬酸、肌酸酐峰面積值存在差異性，而在B 組與C 組間，代謝物丙酮酸、胍基乙酸峰面積值存在差異性。

2.2.2 運動員運動訓練狀態監測心理量表評定值的差異性

計算17 名女子柔道運動員《運動訓練狀態監測量表》調查結果。根據運動員尿液代謝組學分組情況，將運動員運動訓練狀態監測各分量表所得分值在3 個組別間進行統計分析。運用單因素方差分析方法，對各分量表評分進行兩兩比較，發現在心理疲勞分量表上，3 個組別間存在差異性（表3）。

心理疲勞分量表得分在A 組和B 組間存在顯著差異性（P＜0.01；表3）；A 組和C 組間，存在差異性（P＜0.05）。但B 組和C 組間不存在差異性。由均值差可見，A 組均值較B 組和C 組均值更大，故A 組在心理疲勞上較B 組、C組更明顯。而B 組和C 組在心理疲勞上無統計學差異。探究3 個組別運動員運動訓練狀態監測的評定值（表4），發現A 組運動員在心理疲勞和自我調節分量表得分較高，可評價其為心理疲勞狀態，且運動員在進行自我心理調節。B 組、C 組運動員在心理疲勞分量表所得分值相對較低，不評定其為心理疲勞狀態。

表4 3個組別運動員運動訓練狀態監測各分量表均值Table 4 Mean Values of Each Subscale of Exercise Training Status Monitoring in Three Groups

3 分析與討論

3.1 女子柔道運動員尿液代謝組學代謝物核磁指認結果分析

代謝組學的發展與生命科學的發展有關，其考察生物體系受到刺激或擾動后的代謝產物變化或其隨時間的變化情況。代謝組學基于分子生物學的發展，是反映機體物質代謝末端一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長發育的相對分子質量小于1 000 的內源性小分子化合物的集合。代謝組學中代謝物的數量龐大，可以客觀地反映人體受外界影響所產生的變化。尿液是機體代謝物排出的主要形式，故通過測試尿液中的代謝產物獲取到的數據，可精準反映機體代謝狀況。

代謝組學核磁共振技術基于具有自旋性質的原子核，在核外磁場的作用下吸收射頻輻射，產生能級躍遷，以得到核磁共振波譜，常用的波譜包括氫譜、碳譜、氮譜等，其中氫譜是目前研究較為充分的波譜。通過化學位移、耦合常數及峰面積等數值來反映代謝物的特征。采用數學統計手段及數據分析方法得出分布圖譜，客觀反映樣本代謝物在群組中的分布特征，有共性的樣本具有聚類特征。

根據17 名女子柔道運動員的代謝物PLS-DA 分析得分圖，將具有聚類特征的樣本分為A 組、B 組和C 組，各組間樣本的代謝物差異性反映了不同組別運動員的代謝狀況。由于受到核磁共振波譜分析技術的影響，使得對代謝產物歸屬與識別受限。本研究共指認出了24 種代謝物，峰面積值可反映樣品中各組分的相對含量，對所指認的24 種代謝物峰面積值進行組間比較，可了解不同組別間代謝物相對含量的差異性，這些差異性與各組運動員的機能代謝狀態相關。未經指認的代謝物在不同組別間的差異性，也是影響各組運動員機能狀態的重要因素。

3.2 女子柔道運動員尿液代謝組學代謝物與運動訓練狀態評定的相關性

運動員的運動訓練狀況可通過評定機體的生理生化指標和心理指標進行運動監測，生理生化指標可在客觀上反映運動員生理機能對運動負荷的適應性變化。運用代謝組學方法研究運動訓練代謝物特征，可從物質代謝層面分析運動員對運動負荷的反應以及運動疲勞的狀態。姚曉丹等（2017）的研究認為，代謝組學更全面、敏感、客觀地反映了運動員訓練和賽后機能的代謝狀況，有利于早期發現過度疲勞、過度訓練等問題。根據心理學指標對運動員心理狀況進行客觀評價，反映出其對運動負荷的承受能力。由于沒有對運動員進行精確、有規律地監測以及未建立個體的基線水平或“正常范圍”，部分學者認為心理學指標有時比生理生化指標能夠更早、更有效地確定過度訓練（張力為 等，2010）。將生理學方法和心理學方法相結合，可進一步認識到多因素、多層次交互作用的重要性（張力為，2005）。

基于女子柔道運動員尿液代謝組學代謝物PLS-DA 分析得分圖分組情況，對運動員心理量表評價得分在不同組別間進行組間比較，反映出不同組別間運動員運動訓練狀態的差異性。研究發現，在運動訓練狀態監測心理量表的8 個分量表中，心理疲勞量表在A 組與B 組、A 組與C 組間存在明顯的差異性，且A 組得分較B 組、C 組更高，故A 組運動員在運動訓練后心理疲勞較B 組、C 組更明顯。因此，運動員尿液代謝組學指認出的代謝物可能與運動員運動訓練狀態監測的心理疲勞程度相關。

將不同組別運動員尿液代謝組學代謝物的峰面積值在組間進行逐一比較分析，發現心理疲勞明顯的A 組，其代謝組學代謝物纈氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、膽堿相對含量較B、C 組更高。這些代謝物涉及到了氨基酸代謝、物質有氧氧化等代謝途徑。從代謝途徑上，將運動員運動訓練后代謝反應特點與運動員運動訓練心理狀態聯系在一起。

3.3 女子柔道運動員代謝組學代謝物的特點與機體的運動應激-適應

對女子柔道運動員運動訓練期間尿液代謝組學特點進行研究，發現A 組運動員的尿液代謝組學代謝物在纈氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、膽堿上較其他組別存在一定差異性，其代謝物相對含量更高。這可能是運動員由于運動應激，受內分泌影響，使機體代謝活動增加，從而適應運動的生理反應，這與高浩恩等（2019）的研究結果一致，即在運動訓練中，高強度間歇性訓練組和中等強度持續訓練組在膽堿、谷氨酰胺、支鏈氨基酸特異性上有所增加，為其對訓練的代謝所產生的適應性變化。

膽堿由絲氨酸和甲硫氨酸在體內代謝合成。絲氨酸脫羧后生成乙醇胺，乙醇胺由S-腺苷甲硫氨酸獲得3 個甲基即可合成。在機體膽堿與乙酰輔酶A 合成乙酰膽堿，而乙酰膽堿是中樞神經系統膽堿能神經遞質。由于運動應激，機體膽堿水平有所提高。黃彩華等（2011）的研究表明，格斗項目運動員具有較高的迷走神經活性。故運動員代謝物膽堿的生成可能與其對柔道運動項目的適應性有關。Gonzales 等（2013）的研究表明，中等強度運動使膽堿特異性增加，機體膽堿水平間接性地反映了機體對運動的適應。

運動中補充膽堿可以改善機體代謝，提高運動能力。陳秀英（2004）認為，膽堿補充可使中樞乙酰膽堿的相關機制得以改善，中樞神經系統乙酰膽堿的合成受血漿膽堿供應的限制。Qolizadeh等（2011）在關于膽堿對運動中脂質代謝影響的研究中發現，在長時間的運動訓練中，補充膽堿可以促進機體脂肪代謝生成游離脂肪酸，也可促進游離脂肪酸代謝生成β-羥丁酸，從而促進脂類物質供能，節約糖類物質及促進運動后機體糖原的合成，進一步促進機體的恢復。

機體谷氨酰胺的生成是固定無機氮原子，經代謝將無機氮原子固定為氨基的過程。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化作用下，還原氧化生成谷氨酸。谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的催化作用下，將無機氮原子固定為酰胺基生成谷氨酰胺。Swiatkiewicz 等（2017）對谷氨酰胺的研究表明，運動可使機體谷氨酰胺功能被激活。谷氨酰胺是中樞興奮性遞質，在神經系統突觸間進行谷氨酰胺-谷氨酸循環。運動時，大腦區域被激活而增強了谷氨酰胺-谷氨酸循環的周期。例如，大鼠在跑步機上進行力竭運動后，對小腦、紋狀體和海馬體中提取物使用磁共振掃描儀，記錄1H NMR 譜，研究運動對谷氨酰胺-谷氨酸的影響。這種力竭運動時谷氨酰胺的變化具有一定的統計學意義。該研究認為，在大鼠的小腦和海馬體中發現谷氨酰胺的信號有所增強，可能是機體功能被激活所致。谷氨酰胺是機體氨的載體，是氨在機體內安全轉運的形式。谷氨酰胺對機體具有對抗自由基、提高免疫機能以及延緩疲勞的作用。Koo 等（2014）的研究表明，相對于安慰劑組和支鏈氨基酸組，谷氨酰胺的補充在恢復階段對減少疲勞因子具有積極的影響。

纈氨酸與亮氨酸、異亮氨酸合稱為支鏈氨基酸（branched-chain amino acids，BCAA），為機體的必需氨基酸。BCAA 可在骨骼肌中被氧化，其分解代謝產物進入三羧酸循環，進一步實現有氧氧化或糖異生。纈氨酸在機體代謝產生琥珀酰輔酶A，其為機體三羧酸循環的中間物質，在琥珀酸酶的作用下，生成琥珀酸和輔酶A。琥珀酸在三羧酸循環中徹底代謝后生成CO2和H2O，并伴隨能量的生成。

因此，在運動訓練過程中，運動員通過對運動負荷的應激，達到機體代謝機能對運動的適應。通過提高運動員膽堿、谷氨酰胺、纈氨酸水平，可提高整體運動能力。運動負荷的強度決定了應激的程度和機體代謝的特點（張蘊琨 等，2014），由于運動負荷強度的增加，機體應激程度也隨之增加。當身體機能不能維持特定的運動強度時，即出現了運動性疲勞。因此，運動疲勞是評價運動訓練負荷的指標。應激也是所有心理疲勞的共同誘因（張力為 等，2006）。在運動人體科學研究領域，代謝組學研究也被應用于生理和心理應激方面（馬海峰 等，2015）。

對女子柔道運動員代謝組學特點和運動訓練心理監測評價進行分析，發現A 組運動員心理疲勞明顯，且運動員自我心理調節評定值較高，其代謝物水平由于自我調節運動應激而得以提高。這可能是由于運動員在運動訓練后，在生理指標上持續保持對運動負荷的適應性，從而產生了機能水平提高的生理反應，但從運動員運動訓練狀態監測評價來看卻已出現了心理疲勞狀態。通過分析心理疲勞指標和生理代謝物質指標，合理地評價運動負荷對運動員機能狀態的影響，是值得進一步研究的課題。

4 結論

基于1HNMR 代謝組學技術，對運動員尿液代謝組學代謝物特點進行分析，可以從整體上全面、客觀地反映出運動員在運動訓練后機體的物質代謝與能量代謝狀況。對運動員尿液代謝組學特征進行聚類分析，可以反映運動員對運動訓練負荷產生的不同代謝機能狀態，對指導運動訓練具有一定的理論意義。

從運動員在運動訓練后的機體代謝物角度，分析了運動員機體機能對運動訓練負荷的運動應激-適應與運動員較早出現的心理疲勞間的關聯性。運用代謝組學技術，可對運動員生理機能進行監測及評價運動訓練負荷。