基于iTRAQ技術對化療所致認知障礙機制的研究

周雅卿 馬 莉 王 力 李維妙 劉偉東 趙永林

一些腫瘤患者在化療期間和化療后出現認知能力下降,這種認知障礙通常被稱為化療相關認知障礙(chemotherapy-induced cognitive impairment,CICI),也稱化療腦(chemo-brain),主要表現為患者的記憶力衰退,學習能力下降,注意力、推理能力及執行能力等方面較前減退。在癌癥幸存者中CICI的患病率為14%～85%,最常見的癥狀是記憶力以及注意力較前減退。CICI具有差異性,多數情況下是短暫且可逆的,但也可以持續數年,或有更嚴重的進行性惡化,從而影響患者的生活質量[1]。

目前對于CICI的發病機制尚無定論,CICI的發生可能與化療導致的海馬細胞損傷、DNA損傷、修復障礙、炎性反應、激素水平變化等有關,且目前國內外尚無有關CICI發生后腦組織蛋白質水平的變化和系統研究。iTRAQ技術聯合液相色譜串聯質譜常用于蛋白質組定量,可以篩選出差異蛋白。本研究擬應用iTRAQ技術檢測經阿霉素和環磷酰胺處理后大鼠海馬組織的差異表達蛋白,有助于揭示CICI的發生機制,并尋找其潛在的生物學標志物。

材料與方法

1.實驗動物及大鼠CICI模型制備:由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供6只具有相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠,體質量為250～300g,動物試驗許可證號:SCXK(陜)08-018,西安交通大學醫學部生物醫學倫理學委員會已批準此次實驗倫理。隨機將6只健康成年雄性SD大鼠分為化療組及對照組各3只。化療組大鼠尾靜脈注射環磷酰胺(40mg/kg)和阿霉素(4mg/kg),每周1次,連續3周;對照組注射等劑量的0.9% NaCl注射液。

2．取材及樣品制備:末次給藥結束后1周,腹腔麻醉兩組大鼠后快速開胸,經左心室插管至主動脈后開始灌注0.9% NaCl注射液,待流出液清亮后迅速取大鼠海馬組織,置于無菌凍存管后,于干冰中凍存運輸。

3．蛋白提取、定量質檢及質譜分析:將組織解凍后加適量含EDTA的Cocktail,置于冰上5min,加入終濃度為10mmol/L的DTT后裂解,離心后取上清,加入10mmol/L的DTT,56℃中水浴1h。加入IAM(55mmol/L)后避光靜置45min,離心后取上清。考馬斯亮藍染色法測定蛋白濃度,采用SDS-PAGE電泳法評估樣品質量。取100μg蛋白液加入到1.5ml離心管中,37℃酶解4h。對肽段消化后除鹽并冷凍抽干,用TEAB溶解肽段樣品后對其進行標記及分離后冷凍抽干,用流動相A復溶肽段后離心取上清。使用美國Thermo公司UltiMate 3000 UHPLC進行分離。將液相分離后的肽段通過nanoESI源離子化后進入串聯質譜儀進行DDA模式檢測。

4.生物信息學統計:將原始質譜數據轉成MGF格式后經Mascot軟件和蛋白質序列數據庫比對搜索得到的蛋白鑒定結果。同時進行質控分析,并對所得蛋白質鑒定結果進行篩選。隨后經iTRAQ定量分析篩選顯著差異蛋白,通過超幾何檢驗對差異蛋白進行富集分析。利用STRING蛋白互作數據庫對差異表達蛋白進行互作分析,繪制網絡互作圖。

結 果

1.差異蛋白鑒定及定量分析:利用Mascot2.3.02軟件在Rattus_norvegicus數據庫中進行蛋白鑒定和分析,共鑒定出52764 條肽段和7670個蛋白,進行iTRAQ定量分析,以iTRAQ比值>1.2和P<0.05兩個條件篩選,共鑒定出434種差異蛋白,與對照組比較,化療組上調338種蛋白,下調96種蛋白(圖1)。

圖1 實驗組與對照組差異蛋白火山圖

2.差異蛋白生物信息學分析:通過顯著差異蛋白和作為背景的全體鑒定蛋白比較,利用超幾何檢驗(P<0.05)找出顯著富集的GO條目,依據相關生物學過程、細胞組成、分子功能對化療組與對照組的差異表達蛋白進行GO分類富集,結果顯示差異蛋白主要富集于細胞組分、細胞器、細胞膜等細胞成分;參與細胞過程、生物調節、代謝過程等生物學過程;顯著富集于結合、催化、調節等分子功能(P<0.05),詳見圖2。

圖2 差異蛋白GO富集分析

3.差異表達蛋白KEGG通路富集分析結果:對差異表達蛋白進行KEGG信號通路富集分析,結果顯示其主要富集的通路有單純皰疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等,詳見圖3。

圖3 差異蛋白KEGG通路富集氣泡圖

4.差異蛋白互作網絡分析:對化療組和對照組的差異蛋白進行蛋白互作網絡分析,發現差異蛋白主要與免疫相關,與KEGG通路富集分析一致,其中信號>轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)及泛素樣修飾劑ISG15連接度較高。

討 論

在過去幾十年中,由于認為化療藥物不會通過血-腦脊液屏障損傷大腦以及對化療后患者后續隨訪的缺失,導致研究者忽視了CICI這一化療常見不良反應。隨著長期癌癥幸存者人數的逐年增加及對化療不良反應的深入探究,CICI受到了越來越多的關注。目前對CICI的認定依靠于標準化的神經心理學測試、電生理及神經影像技術等,對于CICI的診斷仍缺乏客觀、有效的指標。另外,有關CICI 的機制還尚不明確,基于目前的研究其可能機制包括直接的神經毒性作用、血-腦脊液屏障的破壞、海馬功能障礙、神經元增殖破壞、繼發性炎性反應、白質異常、氧化應激增加和腦血流改變等[3]。

本研究擬通過iTRAQ技術發現潛在的靶點蛋白,為CICI機制的研究及篩選可能的生物學標志物提供相關科研依據。本實驗共篩選出434種差異蛋白,其中上調的差異蛋白有338種,下調的有96種,對差異蛋白進行GO 功能富集分析,結果顯示差異蛋白主要富集于細胞器、細胞膜等細胞成分;主要參與細胞代謝過程、生物調節及代謝過程等生物學過程;顯著富集于結合、催化等分子功能。對差異蛋白進行KEGG信號通路富集分析顯示其主要富集于單純皰疹病毒感染、免疫排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等與免疫相關的通路。通過構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡發現信號轉導及STAT及泛素樣修飾劑ISG15處于中心位置,均與免疫相關,與KEGG通路富集分析結果一致。

聯合使用阿霉素和環磷酰胺被廣泛用于腫瘤患者的輔助化療,盡管阿霉素及其主要代謝物均未穿過血-腦脊液屏障,但仍會導致腦損傷,可能的機制包括氧化應激增加、促炎性細胞因子水平升高、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平升高和線粒體功能障礙[4～7]。輕松穿過血-腦脊液屏障或通過腦室器官進入大腦的促炎性細胞因子可以激活小膠質細胞,加劇損傷部位促炎性細胞因子的產生。小膠質細胞激活后活化巨噬細胞釋放促炎性細胞因子,在神經炎癥中有至關重要的作用[8]。此外,即使不進入大腦,促炎性細胞因子也可以通過破壞血-腦脊液屏障的微血管內皮細胞間的緊密連接,增加其通透性[9]。在結果中IFN-γ顯著上調,IFN-γ廣泛參與先天性和適應性免疫反應的調節。Shechter等[10]研究發現在脊髓損傷后,單核細胞歸巢于受損組織分為兩個階段。第一階段,受損組織周圍軟腦膜可協助循環單核細胞集中于受損組織成為具有促炎作用的M1型巨噬細胞,IFN-γ參與M1型巨噬細胞的活化。第二階段,脈絡從可通過調節 IFN-γ/IFN-γR 信號轉導協調單核細胞進入中樞神經系統成為具有抗炎作用的M2型巨噬細胞,決定了中樞神經系統損傷后的免疫監視及損傷恢復[10,11]。神經炎癥是CICI可能機制之一,通過調控IFN-γ或控制單核細胞進入中樞神經系統從而減輕神經炎癥有望改善CICI。

JAK/STAT通路在先天性免疫和獲得性免疫的啟動和調節中起著關鍵作用,JAK/STAT途徑的異常激活在多發性硬化癥和帕金森病等神經炎性疾病的發病機制中有重要作用[12]。細胞因子和神經營養因子與細胞膜上的特異性受體結合,使受體亞基多聚化誘發細胞內激活,激活的JAKs磷酸化酪氨酸殘基與STAT對接,致使STAT磷酸化形成二聚體,二聚化的STAT從細胞質易位到細胞核中,通過與特異性DNA元件結合調節細胞因子反應基因的表達[13]。本研究結果顯示,在JAK/STAT通路中,上調的細胞因子及神經營養因子激活JAK/STAT通路,二聚化的STAT進入細胞核后使AOX表達上調,AOX通過調控脂質代謝影響細胞周期。但JAK/STAT通路作用機制十分復雜,需進一步研究確定其對CICI的影響。

下調的差異蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶使絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1磷酸化抑制前體mRNA選擇性剪接,提示可能與CICI有關,但需要進一步的研究證實。

目前對于CICI的機制還缺乏明確及清晰的認識,本研究利用iTRAQ技術篩選與CICI有關的通路及蛋白。結果進一步說明CICI與神經炎癥有關,尤其是CICI與自身免疫的相關性值得進一步研究。細胞因子,特別是IFN-γ可能是CICI潛在的生物學標志物及治療靶點。本研究為后續CICI機制的探究提供了一定的方向及依據,希望在此基礎上有更深層次的研究揭示CICI的發病機制,為緩解及治療CICI帶來新希望。