應用質譜技術篩選子癇前期的潛在生物學標志物

孫春蕾 謝瑩鶯

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder of pregnancy,HDP),其全球發生率為2%～8%,是孕產婦、胎兒和新生兒死亡的主要原因[1]。迄今為止,PE的發病機制尚不明確。公認PE是多病因、多機制、多階段發展的復雜病理過程,2014年Redman[2]提出了PE的“六階段模式”學說,其中第2階段,即妊娠第8～18周,胎盤形成異常出現應激反應,各種胎盤源性的損傷因子釋放進入母體血液循環,缺血導致胎盤因子釋放和血管生成因子失衡,這種異常侵襲導致全身內皮功能障礙[3]。因此,研究者將注意力集中在與PE相關的血管生成和病理生理異常相關的因素上,如胎盤、內皮功能障礙以及全身炎癥等。

多年來,許多篩選試驗(臨床檢查和生物學標志物)已被評估用于預測PE。目前,蛋白質組學技術已被廣泛應用于篩選各種疾病的生物學標志物,通過應用基于質譜(mass spectrometry,MS)的蛋白質組學技術可以快速并且大規模的進行蛋白質識別,可用于量化數千種蛋白質,并進一步確定其修飾、定位和相互作用[4]。基于MS的蛋白質組學在增加生物學標志物庫以發現新的生物學標志物方面具有巨大潛力,這些生物學標志物有望發掘出PE的發病途徑和分子機制,從而能夠準確診斷疾病。

一、蛋白組學技術與PE疾病

基于MS的蛋白質組學技術被應用于鑒定新的PE標志物,并致力于分析母體血清、血漿、尿液和胎盤滋養層細胞。PE起源于胎盤,在胎盤水平上監測蛋白質變化是檢測PE的病理變化和確定相關生化途徑和機制的最佳方法[5]。因體液(如血漿、腦脊液或尿液)在體內分布且容易獲取,常被用于蛋白質組學研究[6]。血漿和血清都是易于獲取且廉價獲得的生物液體,可以全面反映疾病狀態下器官功能的變化。尿液也是發現PE生物學標志物的良好生物流體,尿蛋白質組學可以在疾病早期階段不通過腎活檢的情況下檢測并識別腎臟疾病,是臨床研究的進一步領域[7]。目前,基于MS的蛋白質組學技術已鑒定出大量可能與PE有關的蛋白質生物學標志物,包括促血管生成因子、抗血管生成因子、胎盤生長因子、氧化與抗氧化因子及促炎性細胞因子等。因此,這些篩選出的差異蛋白還需要深入研究。

二、參與PE發病相關的生物學標志物

1.促血管生成因子與抗血管生成因子

(1)血管內皮生長因子、可溶性fms樣酪氨酸激酶1與胎盤生長因子:PE是一種以抗血管生成狀態為特征的妊娠特異性疾病,抗血管生成因子(如可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase1,sFlt1)和可溶性內皮素(soluble endoglin,sEng)的表達水平升高。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種由巨噬細胞、T淋巴細胞和滋養層細胞組成的蛋白質[8]。VEGF能促進血管生成,增加血管通透性和血管擴張,從而降低血管張力和血壓[9]。Tarca等[10]的一項針對預測PE的縱向蛋白質組學研究表示,當使用線性混合效應模型建模,將數據轉換為胎齡平均值的倍數后,擬合每個胎齡區間后。發現妊娠在22.1～28.0周時,VEGF聯合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素6(siglec-6)和激活素-A可用來預測并區分早發型子癇前期(early onset preeclampsia,EOPE)和晚發型子癇前期(late onset preeclampsia,LOPE),敏感度為77%,假陽性率為10%。VEGF建立的血漿蛋白模型對早發型PE、重度PE和有潛在血管性胎盤病變的女性中有較高的敏感度,可在疾病早期對患者進行早期的干預和指導避免發展為重度PE和子癇。血管內皮生長因子受體1的可溶性形式sFlt1,由胎盤釋放到母體血液循環中,在循環和局部組織中作為清除劑結合VEGF、胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF),中和VEGF和PLGF的血管生成作用,阻止它們與內皮細胞上的膜受體相互作用導致循環VEGF和PLGF水平降低,導致內皮功能障礙[11]。Rasanen等[12]利用多維液相色譜-串聯質譜技術(2D-LC-MS/MS)分析輕度、重度PE患者和正常妊娠女性的血清蛋白質組學研究得出,與正常血壓妊娠比較,LOPE的患者,其妊娠早期sFlt1濃度并沒有顯著差異,也就是sFlt1的升高是從妊娠晚期才開始變化的。Lim等[13]開展的一項生物學標志物對PE不良結局預測的綜述和Meta分析中指出,PLGF和sFlt1可能在EOPE中的預測效果更好。已經證明PLGF和sFlt1/PLGF比值在預測PE不良結局方面表現良好,SROC在0.68～0.79。PE是一種異質性疾病,這種異質性限制了在臨床實踐中使用這些生物學標志物,因此,在臨床實施之前,需要對結果進行進一步的標準化研究。在未來,從恢復血管生成失衡的新型臨床和治療策略入手有望改善PE患者的并發癥并延長妊娠期。

(2)內皮素:內皮素(Eng,CD105)是一種膜結合糖蛋白,被基質金屬蛋白酶切割形成可溶性內皮素(sEng),釋放到血液循環中。PE患者中血清sEng濃度的升高干擾TGF-β/ALK1(激活素受體樣激酶-1)/Eng信號通路的發展,導致細胞功能改變和內皮功能障礙[14]。Rasanen等[12]利用多維液相色譜-串聯質譜技術(2D-LC-MS/MS)研究篩選出的差異蛋白提示,重度PE患者的Eng含量高于輕度PE患者,Eng含量可能會提示疾病的嚴重程度。Tu等[15]利用相對和絕對定量的等壓標簽(iTRAQ)結合液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術分析評估EOPE和LOPE患者血清蛋白質的差異表達得出,Eng表達在EOPE中上調,但在LOPE組中沒有上調。sEng可以作為EOPE篩查的預測因子。在妊娠早期通過測定sEng識別EOPE,然后立即開始阿司匹林預防,將最大限度地提高妊娠率,可以通過生物功能分析Eng所在的信號通路,對其他相關蛋白行進一步研究[16]。

2.胎盤生長因子

(1)妊娠相關血漿蛋白A:妊娠相關血漿蛋白A (PAPP-A)是胰島素樣生長因子生物利用度的關鍵調節因子,對正常胎兒發育至關重要。PAPPA2可分解IGFBP3和IGFBP5。PAPPA2通過增加IGFBP5水解抑制胎盤細胞滋養層細胞的侵襲[17]。Tu等[15]利用iTRAQ結合LC-MS/MS分析評估EOPE和LOPE患者血清蛋白質的差異表達研究得出,與正常妊娠組比較,EOPE組的PAPPA2蛋白表達水平增加,在LOPE組中未檢測到差異性改變,可能PAPPA2在妊娠早期影響胎盤滋養層的侵襲和轉移,并導致胎盤功能逐漸下降。PAPP-A可早期與多普勒超聲及其他生化標志物和母體因素結合用于PE的篩查[18]。

(2)PSG:PSG是一種妊娠特異性糖蛋白,由胎盤合胞滋養層細胞合成并分泌到血液中。Rong等[19]研究發現,PSG9顯著促進人臍靜脈內皮細胞的血管生成。Tu等[15]利用iTRAQ與LC-MS/MS聯合評估發現,與正常妊娠組比較,LOPE組中PSG1和PSG9蛋白表達下調。PSG蛋白家族的下調可能通過影響內皮細胞的增殖而參與PE的發病機制,目前針對PSG 的研究還較少,這一假設還需進一步具體實驗支持和驗證。

(3)人胎盤生乳素:人胎盤生乳素(human placental lactogen,HPL)又稱絨毛膜促生長泌乳素,由胎盤細胞滋養層細胞合成,主要分泌入母體血流。Bersinger等[20]研究發現,HPL可作為監測HDP時胎盤狀態的一個指標。有研究利用基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF/TOF-MS)研究發現,與正常妊娠比較,PE患者胎盤組織中HPL蛋白的表達水平降低。Li等[21]研究得出,母體血漿中HPL mRNA升高可能提示胎盤浸潤性異常相關的疾病。相反,在PE這種以胎盤淺層浸潤為特征的疾病的患者中觀察到HPL mRNA水平降低,故HPL水平的測定有可能成為妊娠后PE篩查的指標。

(4)胎盤蛋白13:胎盤蛋白13(placental protein 13,PP13)也稱為半乳糖凝集素13(galectin-13,Gal-13)。半乳糖凝集素是一種碳水化合物結合蛋白,其家族與炎癥、免疫反應和細胞凋亡有關。PP13在懷孕期間促進子宮動靜脈擴張,維持母體血管結構的穩定性。Giguère等[22]還通過系統綜述發現,PP13與PPAP-A、整合素樣金屬蛋白酶12、激活素、抑制素和子宮動脈多普勒檢查或其他檢查相結合可以提高PE的預測效果。PP13對預測PE有一定價值,但仍需更多數據進行評估。

3.氧化劑和抗氧化因子之間的平衡

(1)線粒體蛋白:胎盤線粒體是PE氧化應激的重要來源,線粒體脂質過氧化增加可能導致PE胎盤線粒體功能障礙。線粒體功能受損,導致能量產生異常,可能是胎兒-胎盤功能障礙的關鍵因素[23]。Shi等[24]利用胎盤線粒體蛋白質組學定量分析探討重度PE病理生理學,得出PE組及早產兒PE組過氧化還原酶3(peroxiredoxin 3,PRDX3)的蛋白表達水平分別低于正常妊娠組及足月PE組(P<0.01)。Mary等[23]通過無凝膠蛋白質組學技術對正常妊娠和PE患者的胎盤蛋白質組進行比較,確定了除線粒體PRDX5外,抗氧化酶的過氧化物酶(PRDX1、2、3、4、6)蛋白家族均在PE中表達上調。抗氧化水平的增加可能是細胞對活性氧的防御機制的結果,而PRDX5的下調可導致線粒體功能障礙。此外,氧化抵抗蛋白1(oxidation resistance 1,OXR1)在氧化應激、線粒體DNA完整性和凋亡中起作用的重要蛋白質,該蛋白在PE中被發現下調。這是OXR1參與PE的首次報道,然而線粒體蛋白在PE中的作用還需要進一步通過滋養層細胞的體外功能實驗研究來證實。

(2)對氧磷酶1:對氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1) 是一類具有高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)相關性且具有心血管保護作用的芳香酯酶,在預防心血管內皮功能受損方面發揮重要作用。Ding等[25]應用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術分析正常妊娠和PE患者的尿液樣本,得出PE患者的血清PON1較正常妊娠者蛋白表達水平升高。考慮與PE的氧化應激有關,因為PE的病因學說之一就是氧化應激破壞血管內皮細胞,PE患者小血管痙攣導致肝臟受損,而肝臟是分泌PON1的主要器官之一,因此肝臟損害可能會導致肝細胞分泌 PON1的能力下降,從而PE患者的PON1表達水平增加。HDP是影響心腦血管系統的相關性疾病,PON1是否可以與其他影響心腦血管內皮功能的蛋白質一起聯合作為PE的預測蛋白,還需進一步實驗研究。

(3)熱休克蛋白:熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是一種高度保守的蛋白質,廣泛存在于生物體或細胞中,在蛋白質復合物的形成、細胞周期調節和免疫調節中起著關鍵作用。HSP70參與多種生理過程,如蛋白質折疊,并能保護細胞免于凋亡。胎盤缺血、氧化應激和母體炎性反應可介導HSP70的表達。Mary等[25]利用MALDI-TOF/TOF-MS技術研究得出PE患者的胎盤蛋白質組中HSP90B1、HSPA5、HSPA9蛋白表達顯著高于正常妊娠女性。Wang等[26]評估了來自于熱休克蛋白β-1 (heat shock protein β-1,HSPB1)的差異表達肽(AEDPPE)在脂多糖誘導的類PE大鼠模型中的作用,發現AEDPPE顯著改善了PE癥狀和胎鼠結局,AEDPPE的應用有望成為一種治療PE的新方法。

(4)視黃醇結合蛋白4:視黃醇結合蛋白4(retinol-binding protein,RBP4)是一種21kDa的蛋白質,是從肝臟到外周組織的視黃醇(維生素A)的特殊載體。Lu等[27]利用1-D凝膠聯合LC-MS/MS技術研究結果顯示,重度PE患者的RBP4濃度顯著低于正常妊娠女性。Transwell侵襲試驗驗證隨著RBP4濃度的升高,JEG-3細胞的侵襲能力增加。說明在PE患者胎盤發育過程中,滋養細胞侵襲能力降低導致滋養層無法深入侵入子宮肌層,也無法適當重塑子宮螺旋動脈。血流減少和胎盤灌注減少會導致胎盤缺血,產生隨后的氧化應激和血管生成失衡,RBP4濃度降低從而進一步導致PE患者妊娠后期內皮功能障礙的發展。

4.促炎性細胞因子

(1)P物質:SP是具有血管擴張作用的神經肽,通過內分泌或旁分泌因子起作用,直接作用于血管平滑肌,引起血管舒張,血壓降低。參與多種炎癥過程,促進前列腺素E(prostaglandin E,PGE) 和一氧化氮(nitric oxide,NO)合成與釋放的作用減弱,血漿中PGE和NO等舒張血管的物質水平顯著降低。李莉等[28]利用2-DE凝膠聯合電噴霧串聯質譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)技術研究發現,PE患者中P物質蛋白表達水平低于正常妊娠女性。重度PE患者血清中SP蛋白表達下調。故作為生化指標,SP水平下降也有望成為重度子癇前期患者的診斷依據。

(2)絲氨酸蛋白酶抑制劑:Buhimschi等[29]利用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS/MS)技術研究正常妊娠和PE患者的尿液蛋白質組學得出,在PE的尿液蛋白質組中絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(serpin family a member 1,SERPINA1)升高。SERPINA1是一種豐富的血漿蛋白,是主要的血源性絲氨酸蛋白酶抑制劑。血清SERPINA1通過抑制激肽釋放酶-激肽系統的活性,從而導致全身血管收縮和高血壓。尿液中SERPINA1的片段或錯誤折疊形式除了作為生物學標志物外,是否也是PE病理生理學表現的直接參與者,還需要進一步的研究來闡明。

(3)載脂蛋白A-I:Blumenstein等[30]利用ESI-Q-TOF-MS/MS技術從血清組織中測定出PE患者的樣本中載脂蛋白A-I含量升高,這也是載脂蛋白在PE患者研究中的首次報道。載脂蛋白A-I通常由胎盤細胞表達,并作為高密度脂蛋白中的主要脂蛋白,可防止脂質氧化,促進動脈粥樣硬化病變中富含脂質的巨噬細胞的膽固醇外流,并調節細胞黏附分子的內皮表達。因此,在PE患者的胎盤中發現過表達載脂蛋白A-I可能導致血管內皮功能障礙。Blumenstein等[30]使用神經干細胞進行了多變量分析顯示,纖維蛋白原和載脂蛋白A-I重疊于PE-AGA和PE-SGA兩個亞組。載脂蛋白A-I與其他因子的組合準確地區分了那些后來因小于胎齡兒(small for gestation age,SGA)而患上PE的女性和那些沒有并發癥的妊娠女性。但因為包括的女性人數較少,這些蛋白質組需要在更大的篩選研究中行進一步評估。

三、展 望

PE作為圍生期發生率和病死率的主要原因,加強對PE的病因、預測、預防和治療的研究是世界各國研究人員的重要任務。目前,基于MS的蛋白質組學被廣泛應用于PE的研究中。基于MS的蛋白質組學在增加PE生物學標志物庫以及創建一組生物學標志物方面具有巨大潛力,許多可能與PE有關的蛋白質生物學標志物已經被確定,其中VEGF、sFlt-1、PLGF、sENG、PAPP-A、PP13、HSP70等蛋白標志物有望代表PE的多種途徑和分子機制,從而能夠準確診斷疾病,詳見表1。基于MS的蛋白質組學還可以通過將已有的蛋白質生物學標志物聯合起來,建立該疾病的蛋白質模型從而達到疾病預測的效果。另外,MS作為一種高通量的檢測,結合GO注釋和KEGG分析出富集蛋白較多的通路,例如像炎癥、脂質調節、氧化應激等,可研究通路的上下游相關蛋白質,從而作為一種可篩選新的差異蛋白的方法。然而,使用已知的活動性疾病生物學標志物進行妊娠早期篩查,對后續PE的發展預測較少,今后需要開發針對特定胎盤、血管和轉運蛋白的新免疫分析方法可能顯著改善PE的早期預測,有必要通過開展深入的臨床試驗、實驗和組學分析予以證實。

表1 用于預測或檢測母體樣本中PE的潛在生物學標志物總結