基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法和網絡藥理學的沉香化氣片改善胃動力障礙作用機制研究*

蘇泰安，劉 超，吳大章，2△

（1. 太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，重慶 401366； 2. 遵義醫科大學，貴州 遵義 563099）

沉香化氣片收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第七冊）》（WS3-B-1344-93）［1］，由沉香、木香、廣藿香、香附、砂仁、陳皮等10 味中藥組方［2］，方中砂仁、廣藿香、木香為主藥，具有理氣疏肝、消積和胃功效，用于治療肝胃氣滯、脘腹脹痛、胸膈痞滿、不思飲食、噯氣泛酸等癥狀。現代藥理研究表明，沉香化氣片中的成分具有順氣、消食、促進胃動力等作用。其中，木香具有促進胃腸運動、止瀉、保護胃黏膜、抗潰瘍、利膽等作用［3］，對胃排空及腸推進均有促進作用，且呈劑量相關性［4-5］；砂仁具有治療脾胃氣滯、促進腸胃運動的作用［6］；陳皮揮發油具有促胃動力作用［7］，廣藿香中的有效成分廣藿香油可調節胃腸運動，促進消化液分泌、保護腸屏障功能［8］，對理氣疏肝、調中導滯、脘痞不饑［9］有良好的治療作用。中藥復方通過多成分、多靶點、多途徑對機體發揮整體的治療作用，但由于所含成分極復雜，多數復方中的化學成分尚不清楚，難以開展藥物的治療機制研究。故對其化學成分進行全面分析，以明確藥效物質基礎［10］。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC - Q - TOF - MS）法靈敏度、質量精度、分辨率均高，且掃描范圍廣，廣泛應用于中藥物質基礎、新藥開發等領域［11］。網絡藥理學強調從整體出發，從系統和生物學角度融合生物信息學、網絡科學等多種學科，解析藥物與疾病間的分子關聯規律［12］。故本研究中擬通過UPLC - Q - TOF - MS 法和網絡藥理學探討沉香化氣片治療胃動力障礙相關癥狀的作用機制，以為其進一步研究提供理論基礎。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：Thermo ScientificTMVanquishTMFlex UHPLC系統，Q ExactiveTMPlus高分辨率飛行時間質譜儀，均購自美國Thermo Fisher 公司；BAS124S 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為萬分之一）；TGL-20M 型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）。

試藥：沉香化氣片（太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，國藥準字Z50020214，批號為21110114，規格為每片0.5 g）。

1.2 數據庫及軟件

數據庫：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：// lsp. nwu. edu. cn/ tcmsp. php）、PubChem 數據（https：// pubchem. ncbi. nlm. nih. gov/）、PharmMapper數據庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）、Uniprot 數據庫（https：// www. uniprot. org/）、Venny 2.1.0平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、String 數據（https：//string-db.org/cgi/input.pl）、David 數據庫（https：// david. ncifcrf. gov/）、Omicshare繪圖網站（https：//www.omicshare.com/）。

軟件：Cytoscape 3.7.2軟件、Graph Pad Prism 7繪圖軟件、Xcalibur 4.1軟件、Compound discoverier 3.2軟件。

1.3 方法

1.3.1 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，3μm）；流動相為水-乙腈，梯度洗脫（0～1 min時5%B，1～22 min時5%B →95%B，22～26 min時95%B，26～30 min 時95%B →5%B）；流速為0.3 mL/ min；柱溫為30 ℃；進樣量為5μL。

質譜條件：電噴霧離子源，正負離子切換掃描模式；霧化氣溫度（TEM）為350 ℃；源內氣體積流量（GS1，N2）為379.225 kPa；源內氣體積流量（GS2，N2）為275.800 kPa；氣簾氣壓力（CUR）為275.800 kPa，噴霧電壓（IS）為2 500 eV（ESI-）、3 500 eV（ESI +）；去簇電壓（DP）為100 eV；碰撞電壓（CE）為40 eV；碰撞電壓差為15 eV；掃描范圍為質荷比（m/z）100～1 500。

1.3.2 溶液制備

取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，85 ℃加熱回流60 min，放冷至室溫，精密吸取2 mL，置10 mL 容量瓶中，加75%甲醇定容，離心，取上清液，備用。

1.3.3 成分靶點預測和篩選

采用UPLC-Q-TOF-MS 法檢測得到正、負離子模式下的總離子流圖（TIC）。通過Xcalibur 4.1 軟件進行數據采集，并且采用Compound discoverier3.2 軟件進行化合物查找；通過網絡藥理學研究進行雙重驗證，通過TCMSP 平臺獲得其活性成分，進行網絡藥理學成分靶點通路預測分析。通過PubChem 數據庫下載成分的2D 和3D 結構，上傳至PharmMapper 數據庫，獲得成分蛋白靶標。通過Uniprot 數據庫以蛋白靶標的Uniplot ID進行檢索，篩選出物種為人的成分基因；通過Gene-Cards 數據庫，以“soothe the liver and regulate qi”“promote digestion and remove food stagnation”“abdominal distension and pain”“lack of diet”等為關鍵詞，篩選出與胃動力障礙相關癥狀的基因，通過Venny 2.1.0 平臺獲得成分與疾病的交集基因的維恩圖。

1.3.4 富集分析

通過String 數據庫進行基因本體論（GO）功能富集分析，得到生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）分析結果。分別選取富集最顯著的前20 個分析結果，用Graph Pad Prism 7繪圖軟件作柱形圖，實現GO 功能富集分析可視化。通過David 數據庫進行京都基因與基因組萬科全書（KEGG）通路富集分析，用Omicshare繪圖網站繪制高級氣泡圖，進行可視化分析。

1.3.5 蛋白-蛋白互作（PPI）網絡及成分-靶點-通路網絡構建

通過String 數據庫，設定最低互動閾值為0.7，構建PPI 網絡，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建成分-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 沉香化氣片處方成分分析

UPLC-Q -TOF-MS 正、負離子模式下的總離子流圖（TIC）見圖1，共篩選得255 個化學成分；通過TCMSP數據庫篩選出101個交集成分，其中包括異鼠李素、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、5，7-dihydroxy- 2-（3 - hydroxy - 4 - methoxyphenyl）chroman - 4 - one 等主要化學成分。部分成分分析結果見表1。

表1 沉香化氣片化學成分的UPLC-Q-TOF-MS分析結果Tab.1 Results of UPLC-Q-TOF-MS analysis of the chemical components of Chenxiang Huaqi Tablets

A. 正離子 B. 負離子圖1 沉香化氣片總離子流圖A.Positive ion mode B.Negative ion modeFig.1 TIC chromatograms of Chenxiang Huaqi Tablets

2.2 活性成分-疾病靶點網絡

通過Uniprot 數據庫篩選得240 個成分靶點，Gene-Cards 數據庫篩選得682 個疾病靶點，借助Venny 2.1.0平臺得到90個交集靶點。詳見圖2。

圖2 沉香化氣片活性成分-疾病靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of component targets-disease targets of Chenxiang Huaqi Tablets

2.3 富集分析

將得到的90個交集靶點通過String數據庫進行GO功能富集分析，共得到1 694 個條目（P＜0.05），其中BP 條目包括細胞群增殖的調控、細胞對有機物質的反應等1 513 個，CC 條目包括細胞質囊泡、質膜的內在成分等82 個，MF 條目包括信號傳導受體結合、受體配體活性等99個。分別選取富集最顯著的前20個分析結果采用Graph Pad Prism 7繪圖軟件繪制，詳見圖3 A至圖3 C。

A. 生物學過程 B. 細胞成分 C. 分子功能 D.KEGG信號通路圖3 富集分析結果A.Biological processes B.Cell composition C.Molecular function D.KEGG signaling pathwayFig.3 Results of the enrichment analysis

KEGG 通路富集分析共得到100 條信號通路（P＜0.05），其中，癌癥的途徑、癌癥中的蛋白聚糖途徑、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、恰加斯病、乙型病毒性肝炎、弓形體病、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、結核、類風濕關節炎、利什曼病為重要通路。選取富集最顯著的前20個分析結果，采用Omicshare 網站繪制高級氣泡圖，詳見圖3 D。

2.4 PPI 網絡

將KEGG富集最顯著的前20條信號通路的54個靶點導入String數據庫，構建成分與疾病PPI網絡，結果見圖4。該網絡圖共包含視網膜母細胞瘤基因1（RB1）、趨化因子蛋白8（CXCL8）、蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、HIF-1α、表皮生長因子受體（EGFR）、小鼠胱天蛋白酶8（CASP8）、細胞周期素D1（CCND1）等54個節點、488條邊。

圖4 沉香化氣片治療胃動力障礙相關癥狀的蛋白-蛋白互作網絡Fig.4 PPI network of the Chenxiang Huaqi Tablets in the treatment of gastric motility disorders - related symptoms

2.5 成分-靶點-通路網絡

通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建成分-靶點-通路網絡，結果見圖5。網絡中共包含175 個節點、1 246 條邊。成分、靶點及通路的網絡拓撲參數度值中位數分別為5，27，13，詳見表2。評價標準為以大于中位數的為重要節點，大于2 倍中位數的為關鍵節點。可見，槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、甘草查爾酮A（licochalcone A）、葛花苷元（irisolidone）、柚皮素（naringenin）、芒柄花黃素（formononetin）、川陳皮素（nobiletin）、異鼠李素（isorhamnetin）等為重要化學成分；PTGS2、雌激素受體1（ESR1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、TNF、白細胞介素6（IL - 6）、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、白細胞介素1β（IL-1β）、血管內皮生長因子受體A（VEGFA）、EGFR、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等為關鍵靶點；癌癥的途徑、癌癥中的蛋白聚糖途徑、HIF-1 信號通路、恰加斯病、乙型病毒性肝炎、弓形體病、TNF 信號通路、結核、類風濕關節炎、利什曼病為重要通路。

表2 網絡中成分、靶點和通路的拓撲參數分析結果Tab.2 Topological parameter analysis of components，targets and pathways in the network

圖5 成分-靶點-通路網絡Fig.5 Component-target-pathway network

3 討論

本研究中通過UPLC - Q - TOF - MS 法快速分析了沉香化氣片中255種活性化學成分；為探索藥物化學成分與臨床療效間的相關性，采用網絡藥理學方法對鑒定的化合物進行綜合分析，構建藥物- 成分- 靶點網絡，找到沉香化氣片中指標成分如槲皮素、木犀草素、山柰酚、甘草查爾酮A、葛花苷元、柚皮素、芒柄花黃素、川陳皮素、異鼠李素等；同時，通過分析藥物成分所對應的作用靶點，構建了藥物-成分-靶點網絡，并對作用靶點進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，初步明確沉香化氣片對胃動力障礙、疏肝理氣、脘腹脹痛、不思飲食、消食導滯等癥狀的主要分子機制通路、調節的生物學過程作用的細胞組分。由富集分析結果可知，PTGS2，ESR1，NOS2，PPARG，TNF，IL-6，AKT1，STAT3，IL-1β，VEGFA，EGFR，MAPK1等為關鍵靶點，表明沉香化氣片在臨床治療中可能主要作用于這些靶點發揮治療作用；HIF1 信號通路、乙型病毒性肝炎、TNF信號通路、結核、類風濕關節炎、利什曼病等為重要通路。其中，HIF - 1 信號通路和乙型肝炎通路中，HIF是機體應對缺氧代謝的重要調控因子，廣泛參與調控缺氧反應相關的靶基因［13］，其干預可緩解氣機不暢。

UPLC-Q-TOF-MS 法具有高靈敏度、高分辨率、精確相對分子質量測定等優點，已廣泛應用于中藥復雜體系成分的定性鑒別研究［14］。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節，提高藥物的治療效果，減少不良反應，從而提高新藥臨床試驗的成功率，但在實際應用中的局限性也逐漸浮現，如數據庫、分析方法尚不完善，篩選所得活性成分與實際測定藥物成分存在差異，以及無法根據藥物濃度進行藥效物質驗證等［15］。本研究中通過UPLC - Q - TOF - MS 和網絡藥理學對沉香化氣片的潛在靶點進行了預測，但因上述原因導致預測結果具有一定局限性。

綜上所述，沉香化氣片通過多成分、多靶點、多通路可緩解腸胃氣機不暢的癥狀，為其臨床應用前景提供了理論依據。但本研究中仍存在不足，未進一步做動物實驗、細胞實驗及血清代謝物研究，以明確其活性成分-靶點-通路與沉香化氣片功效的相關性。