活菌核酸微定量技術評價抗菌藥物對胞內鮑曼不動桿菌感染的影響*

翁邦碧，李玉良，羅 丹，枉 前△

（1. 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院，重慶 400038； 2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院，云南 昆明 650032）

鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii（AB）為非發酵革蘭陰性桿菌，是引起呼吸道感染的主要條件致病菌。隨著侵入性治療措施的頻繁操作、抗菌藥物的大量和不合理使用，引起多耐藥、泛耐藥、全耐藥AB 不斷涌現，導致臨床可用治療藥物和策略十分有限［1］。雖然臨床是根據抗菌藥物敏感性試驗（簡稱藥敏試驗）最低抑菌濃度（MIC）選擇合適的藥物和治療路徑，但其臨床治療結果與預期仍有差距，重要原因為AB 感染后可進入細胞內，形成胞內菌感染［2-3］，是造成感染遷延不愈、感染復發的重要原因［4-5］。細菌一旦進入細胞內部，一部分可因抗原暴露導致細胞自噬而重新暴露于抗菌藥物環境被殺滅，另一部分則可通過改變自身蛋白或調節代謝強度而長期生存于胞內，可躲避抗菌藥物的接觸及免疫細胞的捕獲，在細胞內長期生存，在宿主免疫力低下時可能會引發慢性感染或感染復發［6］。AB通常被認為是專性胞外細菌，可不同程度地進入細胞內［7-9］，但尚未明確抗菌藥物對AB入侵細胞內數量的影響。目前，多采用慶大霉素保護實驗（GPA）的平板計數法檢測細胞內細菌［10-11］，但該方法存在耗時、工作量大、重復性差的缺點；實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）也常被用于胞內細菌檢測［12］，但難以消除被藥物殺滅的胞外死菌對檢測的干擾。課題組前期采用月桂?；“彼徕c（SLS）/改良疊氮溴化丙錠（PMAxx）去除非活性細菌基因組干擾，構建了1種活菌核酸微定量技術（PMAxx-qPCR），成功運用于AB 快速表型藥物敏感性的測定［13］。本研究中將該技術應用于胞內活菌數量的檢測，以評價抗菌藥物對胞內AB感染數量的影響，以及細胞參與時抗菌藥物對AB藥物敏感性的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌株

儀器：Sorvall ST 16R 型冷凍高速離心機，481 型全溫搖床，B6120 型微生物培養箱，3111 型二氧化碳培養箱，均購自美國Thermo Fisher公司；SW-CJ-2FD型超凈臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；PMA-Lite LED 光解儀（美國Biotium 公司）；CFX - 96 型熒光定量PCR（美國BIO - RAD 公司）；OSE - DB - 01 型五段程控金屬?。ū本┨旄萍加邢薰荆?；LDZX-50KBS 型高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：營養瓊脂平板（重慶龐通醫療器械有限公司，批號為22J2404）；盧里亞-貝爾塔尼（LB）培養基（北京索萊寶科技有限公司，批號為318Q031）；SLS（批號為F321BA0023），引物（批號為9015629），均購自上海生工生物工程股份有限公司；PMAxx（美國Biotium公司，升級版，批號為19P0725）；QuantiNova SYBR Green PCR Kit（批號為169017812），細菌基因組DNA 提取試劑盒（批號為163043064），均購自德國Qiagen 公司；RPMI 1640培養基（美國HyClone 公司，批號為AH29755233）；胎牛血清（德國PAN - Biotech 公司，批號為P140109）；0.25%Trypsin（蘇州新賽美生物科技有限公司，批號為20230105）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢普諾賽生命科技有限公司，批號為WH0023N171）；羅丹明鬼筆環肽（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號為96201203004）；Triton X - 100（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，批號為DH351-464L00150）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技術有限公司，批號為03052120706）；抗菌藥物（中國食品藥品檢定研究院）。

菌株：AB標準菌株ATCC 17978、aba 242，人支氣管上皮（HBE）細胞由本院臨床試驗機構提供；綠色熒光蛋白融合AB（AB-GFP）以基因組重組技術構建，可穩定表達綠色熒光蛋白，由陸軍軍醫大學藥學與檢驗系鄒全明教授課題組惠贈。

1.2 方法

1.2.1 AB 特異性診斷基因（blaOXA-51）檢測

針對blaOXA-51基因設計合成引物和探針，并進行局部序列排比檢索（BLAST）驗證。正向引物為5' -GGTAATGATCTTGCTCGTGCTT - 3'，反向引物為5' -TGTGGTGGTTGCCTTATGGT - 3'［2］。采用試劑盒方法提取細菌基因組DNA，隨后進行qPCR 檢測。反應條件為95 ℃預變性2 min（95 ℃5 s →60 ℃10 s），40 個循環，溶解曲線65 ℃5 s →95 ℃，收集SYBR 熒光信號。qPCR軟件自動計算熒光閾值（Ct）。

1.2.2 細胞外活菌檢測

參照課題組前期已建立的細胞外活菌檢測方法［2］，取700 μL 基因組樣本，12 000g離心5 min，棄上清液655 μL，加PMAxx 5 μL，渦旋15 s，瞬時離心，置暗處孵育5 min，使PMAxx 充分滲入死菌細胞，再置光解儀中光照5 min，按QIAamp DNA Mini Kit 說明書提取細菌基因組。以上述細菌基因組為模板，加入2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/反向引物各0.8 μL、無酶水6.4 μL、模板2 μL，對AB 特異性鑒別基因blaOXA-51進行擴增。

1.2.3 標準曲線建立

取對數生長期的ATCC 17978，麥氏比濁至0.5 麥氏，10 倍比稀釋7 個濃度，得到包括原液在內的8 個溶液。按細菌基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組，進行qPCR 檢測。采用平板稀釋法測定菌液原始濃度，以log（cfu/mL）為橫坐標（X）、熒光Ct值為縱坐標（Y），以最小二乘法繪制標準曲線。

1.2.4 HBE 細胞培養及細菌感染細胞模型建立

以90% RPMI 1640 培養基及10%胎牛血清為完全培養基，在細胞傳代3 次后，將細胞收集于15 mL 離心管中，對細胞懸液進行計數，以完全培養基稀釋至1 ×105個/mL，加500 μL 至24 孔培養板，置細胞培養箱孵育。待細胞生長至約90%密度時，棄上清液，PBS洗滌細胞2 次，加RPMI 1640 培養基500 μL，適應性培養1 h，加5 × 107cfu/ mL 菌液共同培養，感染復數（MOI）約為100。

1.2.5 侵襲時間及MOI 考察

侵襲時間：細胞適應性培養1 h后，加5×107cfu/mL ATCC 17978 菌液500 μL，分別與HBE 細胞共同培養2，4，6，8 h。

MOI：細胞適應性培養1 h后，分別加入5×106cfu/mL、1 × 107cfu/ mL、2.5 × 107cfu/ mL、5 × 107cfu/ mL ATCC 17978菌液500 μL，與HBE細胞共同培養6 h。

棄上清液，每孔加1 mL PBS 洗滌3 次，再加500 μL含慶大霉素（質量濃度為1 mg/mL）的RPMI 1640 培養基，繼續孵育1 h，以去除細胞外細菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗滌細胞3 遍，以去除上清液中的慶大霉素。加200 μL 0.25%Trypsin-0.4%TritonX-100裂解液（1∶1，V/V），充分裂解細胞后取100 μL 均勻涂布于營養瓊脂平板，24 h后計數。

1.2.6 胞內菌定量檢測方法的檢測結果比較

加細胞裂解液，待細胞內細菌釋放后，分別以平板計數法、qPCR 法、PMAxx - qPCR 法進行胞內ATCC 17978細菌檢測，并比較結果。

平板計數法：取100 μL 細胞裂解液，均勻涂布于營養瓊脂平板，24 h后計數。

qPCR 法：參照QIAamp DNA Mini Kit 說明書提取細胞內細菌基因組。以上述細菌基因組為模板，加2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/ 反向引物各0.8 μL、無酶水6.4 μL、模板2 μL，對AB 特異性鑒別基因blaOXA-51進行擴增。

PMA-qPCR 法：加細胞裂解液，待胞內菌釋放后，同1.2.2項下方法操作。

1.2.7 不同抗菌藥物對胞內菌感染的影響

細胞適應性培養1 h 后，棄上清液，加含藥RPMI 1640 及ATCC 17978 菌液，輕晃搖勻，使細菌與細胞充分接觸，共同置細胞培養箱孵育。棄上清液，每孔加1 mL PBS 洗滌3 次，再加500 μL 含慶大霉素（質量濃度為1 mg/ mL）的RPMI 1640 培養基，繼續于細胞培養箱孵育1 h，以去除細胞外細菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗滌細胞3 遍，以去除上清液中的慶大霉素。取100 μL 0.25% Trypsin 處理細胞2 min，加完全培養基100 μL、RPMI 1640 培養基300 μL，充分混勻后轉移至1.5 mL EP 管，離心（轉速為12 000 r/ min）5 min，取180 μL 按細菌基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組，進行qPCR檢測，計算胞內細菌濃度。

1.2.8 0.1 倍MIC慶大霉素對AB 侵襲HBE 細胞的影響

操作同1.2.7項下至“去除上清液中的慶大霉素”。加4%多聚甲醛1 mL 室溫固定細胞15 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min，加0.1% TritonX - 100 1 mL 處理細胞5 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL 羅丹明鬼筆環肽避光染細胞骨架30 min，PBS漂洗3遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL DAPI避光染細胞核5 min，PBS漂洗3 遍，每次3 min；以800 μL PBS 浸潤細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 8.3 軟件進行統計與作圖。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗，3組及以上比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線

按1.2.3 項下方法進行線性回歸，得回歸方程Y= - 3.235 1X+ 42.076（R2= 0.994 3，n= 6）。結果ATCC 17978濃度在2～7 log（cfu/mL）范圍內與Ct值線性關系良好，提示Ct值可較準確地反映細菌數量。

2.2 HBE 細胞培養及細菌感染細胞模型

結果顯示，空白HBE 細胞在24 h 內正常生長，ATCC 17978及aba 242感染的HBE細胞在8 h起出現固縮、脫落、壞死，隨著感染時間的延長，細胞脫落及壞死逐漸增加，表明已成功建立AB 的細胞感染模型。詳見圖1。

注：綠色箭頭為脫落細胞，黃色箭頭為固縮細胞，紅色箭頭為成片死亡細胞；Control為不加菌液的HBE細胞正常生長對照，Ab為ATCC 17978標準株，aba242為臨床分離AB菌株。圖1 鮑曼不動桿菌對HBE細胞的侵襲作用（×200）Note：The green arrow refers to detached cells，the yellow arrow refers to pyknotic cells，and the red arrow refers to patches of dead cells.Control is the normal growth control of HBE cells without bacterial solution，Ab refers to the ATCC 17978 standard strain，and aba242 refers to the clinically isolated AB strain.Fig.1 Microscopic view of the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE（×200）

2.3 侵襲時間及MOI

侵襲時間：ATCC 17978 入胞量呈時間依賴性，8 h時達到本次實驗最大值（圖2 A），但8 h 時感染細胞已開始逐漸出現固縮、脫落現象（圖1），故選取6 h 為實驗所需時間。

A. 侵襲時間 B.MOI注：ns為P ＞0.05；組間比較，*P ＜0.01，**P ＜0.001。圖3同。圖2 鮑曼不動桿菌對HBE細胞的侵襲時間及MOI考察A.Invasion time B.MOINote：ns refers to P ＞0.05；* refers to P ＜0.01，and ** refers to P ＜0.001 among different groups（for Fig.2-3）.Fig.2 Invasion time and MOI of Acinetobacter baumannii to HBE cells

MOI：在MOI為10～50 范圍時，ATCC 17978 侵襲量無顯著變化；當MOI升至100 時，ATCC 17978 侵襲量顯著增加，故選取MOI為100進行實驗。詳見圖2 B。

2.4 胞內菌定量檢測方法的檢測結果比較

由表1可知，PMAxx-qPCR法與平板計數法所測結果接近，但前者耗時更短（＜2 h，平板計數法為18～24 h）；傳統qPCR法與PMAxx-qPCR法檢測時效相當（＜2 h），但傳統qPCR 法所測結果較另外2 種方法均偏高，提示傳統qPCR 法無法排除死菌及胞外黏附菌對檢測結果的干擾，而PMAxx-qPCR 法則兼具平板計數法的準確性及傳統qPCR法的時效性，可用于細胞內AB檢測。

表1 3種方法的胞內鮑曼不動桿菌定量檢測結果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

表1 3種方法的胞內鮑曼不動桿菌定量檢測結果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

MOI _______________________________________________________________log（cfu/mL）/Ct值200 100___20_____________________________平板計數法2.27±0.51 2.22±0.62 1.78±0.15___qPCR法______________5.36±0.02/23.31±0.06 5.15±0.02/23.98±0.05 4.31±0.08/26.78±0.26___PMAxx-qPCR法_____2.69±0.14/32.14±0.48 2.63±0.15/32.34±0.48 2.35±0.04/33.28±0.14_

2.5 不同抗菌藥物對胞內AB 感染的影響

由圖3 可知，0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環素，以及1 倍、10 倍MIC的多西環素、慶大霉素，均能抑制ATCC 17978侵襲HBE 細胞形成胞內AB；阿奇霉素、左氧氟沙星、多西環素對胞內AB 的形成可能具有劑量依賴性的抑制作用；0.1 倍MIC的慶大霉素對胞內AB 的形成可能具有促進作用；0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環素、多西環素、慶大霉素，均不能有效殺滅胞內ATCC 17978。

注：AZM為阿奇霉素，LEV為左氧氟沙星，DOX為多西環素，SCF為頭孢哌酮舒巴坦，GEN為慶大霉素，TGC為替加環素。圖3 不同種類及不同濃度抗菌藥物對胞內鮑曼不動桿菌感染的影響Note：AZM is azithromycin，LEV is levofloxacin，DOX is doxycycline，SCF is cefoperazoneandsulbactam，GEN is gentamicin，and TGC is tigecycline.Fig.3 Effect of different types and concentrations of antibiotics on the intracellular infection of Acinetobacter baumannii

2.6 0.1 倍MIC 慶大霉素對AB 侵襲HBE 細胞的影響

由圖4 可知，在0.1 倍MIC的慶大霉素作用下，AB-GFP侵襲進入HBE細胞的量顯著增加，與PMAxxqPCR 法測定胞內ATCC 17978 的結果一致，表明0.1 倍MIC慶大霉素對AB侵襲HBE細胞具有促進作用。

A.HBE細胞 B.HBE細胞+AB-GFP C.HBE細胞+AB-GFP+GEN圖4 0.1倍MIC 慶大霉素對鮑曼不動桿菌侵襲HBE細胞的影響A.HBE cells B.HBE cells+AB-GFP C.HBE cells+AB-GFP+GENFig.4 Effect of 0.1 times MIC gentamicin on the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE cells

3 討論

AB 通常被認為是專性胞外細菌，常以黏附的方式定植于宿主，對細胞的侵襲力較弱［7］。有研究顯示，隨著AB耐藥株分離率的逐年升高，AB的臨床分離株顯示出比ATCC 17978 更高的細胞侵襲毒力，并具有在上皮細胞內繁殖的能力［8-9］?；诖?，本研究中納入了臨床常用不同種類的抗菌藥物，并考察了高、中、低濃度（10倍、1倍、0.1倍MIC）作用下，抗菌藥物對AB侵襲入胞的影響。研究發現，在有宿主細胞參與時，中、高濃度（1 倍、10 倍MIC）的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環素、多西環素、慶大霉素均不能有效殺滅胞內AB，提示體外藥敏試驗可能不能完全反映有宿主參與時細菌對藥物的敏感性，可能是感染治療失敗及感染復發的重要原因。LIU 等［2］以上皮細胞為模型，發現不同細菌及不同藥物在細胞內外的最低殺菌濃度具有異質性，A549 及HepG2 上皮細胞內外的最低殺菌濃度可相差高達800 倍。LEHAR 等［3］則以巨噬細胞為模型，測試了萬古霉素、達托霉素、利奈唑胺、利福平環境下耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在巨噬細胞內外的MIC，顯示胞內外MIC相差100～12 500 倍［3］。結合本研究結果及文獻報道，提示經典的體外MIC 試驗可能并不能準確反映抗菌藥物在體內的治療效果，需建立更接近體內環境的藥物敏感性檢測方法，以指導臨床合理選擇抗菌藥物。

體外細胞感染模型是用于評價抗菌藥物體內治療效果的常見選擇［14］，細胞的參與使其較傳統藥敏試驗更接近體內環境，但細胞不可避免地會被細菌“劫持”并進入細胞，進入細胞內的細菌通常存在于細胞的空泡中，以此躲避抗菌藥物的接觸及細胞自噬激活。故建立有細胞參與的MIC 測定方法需首先解決細胞內細菌的定量問題。本研究中建立了檢測胞內AB 活菌的PMAxx-qPCR 法，可有效縮短檢測時長，并具有操作簡便、結果準確、不受死菌干擾的優點，可為建立有宿主參與的藥物敏感性評價方法奠定基礎。

本研究中主要納入臨床抗呼吸道感染常用抗菌藥物，盡管阿奇霉素并不作為常規抗AB 藥物使用，但其常用于囊性纖維化、支原體肺炎或經驗性抗感染治療。本研究結果提示，阿奇霉素在體外具有抑制胞內AB 生長的作用，即使濃度降至0.1 倍MIC，仍可顯著抑制胞內AB 的生長。這可能得益于阿奇霉素良好的組織及細胞穿透性，具有較高的組織及細胞內藥物濃度［15-16］。且阿奇霉素為抑菌劑，可抑制非繁殖期細菌的生長，使入胞后的細菌處于低復制水平［9］。

使用抗菌藥物治療感染性疾病時，患者不可避免會處于0.1 倍MIC階段［17-18］，而部分0.1 倍MIC抗菌藥物可通過增強細菌毒力因子的產生來促進不同細菌的入胞及在細胞內的持留［2］。本研究中發現，0.1倍MIC慶大霉素可能會促進胞內AB 的形成，提示在臨床治療細菌感染時應注意足劑量、足療程使用慶大霉素，盡量縮短患者處于亞抑菌濃度的時間。