大接骨丹葉醇提物高效液相色譜指紋圖譜研究*

張秋瑾，王志華，韓忠耀，杜 娟，楊金鳳△

（1. 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199； 2. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000）

大接骨丹葉為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia angulataOliv. var.intermedia（Harms）Hu 的干燥葉，又稱水冬瓜葉，藥用部位為根皮［1-2］。中華本草記載，有齒鞘柄木用藥部位為根、根皮、樹(shù)皮及葉［3］，貴州少數(shù)民族聚集地、民間及民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)有習(xí)用葉的用藥習(xí)慣［4-5］，提示其具有一定的藥用研發(fā)價(jià)值。當(dāng)前，有關(guān)有齒鞘柄木的研究多集中在指紋圖譜［6-8］、成分［9-12］、譜效關(guān)系［13］、免疫調(diào)節(jié)活性［14］、工藝考察［15］、近紅外快速質(zhì)量控制方法開(kāi)發(fā)研究［16-18］、抗炎鎮(zhèn)痛作用［19］、生藥學(xué)鑒定［20］等方面。研究結(jié)果顯示，大接骨葉具有抗炎鎮(zhèn)痛活性［13］，民間常用于治療摔傷、續(xù)筋接骨［4］等。大接骨丹葉含有金絲桃苷、異槲皮苷、琥珀酸甲酯、Torriangulate A 等成分，而金絲桃苷、異槲皮苷為其指標(biāo)性成分，常用于質(zhì)量控制［5，13］。但當(dāng)前尚無(wú)關(guān)于大接骨丹葉醇提物高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的構(gòu)建及聚類分析和主成分分析的研究報(bào)道。本研究中采用HPLC 法建立了10 批次大接骨丹葉70%乙醇提取物的指紋圖譜，采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行聚類分析，并對(duì)共有峰進(jìn)行主成分分析，以評(píng)價(jià)大接骨丹葉醇提物HPLC指紋圖譜篩選的共有峰所代表成分的科學(xué)性，旨在為大接骨丹葉及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)，以及后期的綜合開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；HH - 8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；PX125DZH 型電子天平（成都川弘科生物技術(shù)有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ3200 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；RE - 3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；WK-1000A 型高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）。

1.2 試藥

大接骨丹葉（編號(hào)為S1 - S10）采自貴州省黔南布依族苗族自治州都勻市大坪鎮(zhèn)和都勻經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)杉木湖，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校李燕副教授鑒定均為正品。其中，編號(hào)為S1的大接骨丹葉采自貴州省都勻市杉木湖（經(jīng)度107°30'52.33″，緯度26°15'46.16″，海拔807 m），采集時(shí)間為2020 年8 月；編號(hào)為S2- S10 的大接骨丹葉采自貴州省都勻市經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)大坪鎮(zhèn)（經(jīng)度107°38'33″，緯度26°13'46″，海拔675 m），采集時(shí)間為2020 年3 月至12 月。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為CHB180214，純度≥98%），異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為CHB180628，純度≥98%），均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agela Promosil?C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min 時(shí)10%B → 13%B，20～25 min 時(shí)13%B →19%B，25～40 min時(shí)19%B →25%B，40～50 min時(shí)25%B →45%B，50～65 min 時(shí)45%B →70%B，65～65.1 min時(shí)70%B →10%B，65.1～70 min時(shí)10%B）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

分別取金絲桃苷、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加75%甲醇溶解并定容，搖勻，即得金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.052 1，0.053 6 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

取58 ℃烘干大接骨丹葉（編號(hào)為S1-S10）0.5 kg，參考文獻(xiàn)［13］對(duì)樣品進(jìn)行處理，即得大接骨丹葉干膏粉。取干膏粉0.5 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加適量70%乙醇超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）處理5 min 使溶解，再加70%乙醇定容，搖勻，用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得大接骨丹葉醇提物。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一份樣品（編號(hào)為S1）醇提物，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，以峰4 為參比峰［13］，分別計(jì)算11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.08%～0.29%（n= 6）和0.76%～2.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一份樣品（編號(hào)為S1）醇提物適量，共6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰4 為參比峰［13］，分別計(jì)算11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.11%～0.83%（n= 6）和1.03%～2.95%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份樣品（編號(hào)為S1）醇提物，分別于室溫放置0，2，4，6，12，18 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰4為參比峰［13］，分別計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.02%～0.67%（n= 6）和2.04%～2.88%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立與分析

指紋圖譜建立：將大接骨丹葉醇提物（編號(hào)為S1-S10）及金絲桃苷和異槲皮苷混合對(duì)照品溶液HPLC AIA 格式分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版。將S1 作為參照?qǐng)D譜（R），采用中位數(shù)作為對(duì)照?qǐng)D譜生成方法，默認(rèn)時(shí)間窗寬度為0.1 min，構(gòu)建大接骨丹葉醇提物的HPLC 指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果共確定11 個(gè)共有峰，詳見(jiàn)圖1 和圖2。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，指認(rèn)峰4 為金絲桃苷，峰5 為異槲皮苷，詳見(jiàn)圖3。以峰4為參比峰［7］，分別計(jì)算得到11個(gè)共有峰與峰4相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

表1 10批大接骨丹葉醇提物共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab.1 Relative retention time of common peaks in 10 batches of ethanol extract from Toricelliae Intermediae Folium

表2 10批大接骨丹葉醇提物共有峰的相對(duì)峰面積Tab.2 Relative peak area of common peaks of 10 batches of ethanol extract from Toricelliae Intermediae Folium

圖1 10批大接骨丹葉醇提物高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of ethanol extract from 10 batches of Toricelliae Intermediae Folium

圖2 大接骨丹葉醇提物（編號(hào)為S4）高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of ethanol extract from Toricelliae Intermediae Folium（S4）

4. 金絲桃苷 5. 異槲皮苷?qǐng)D3 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖4.Hyperoside 5.IsoquercitrinFig.3 HPLC chromatogram of the mixed reference solution

相似度評(píng)價(jià)：通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版對(duì)10批大接骨丹葉醇提物進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度為0.980～0.999，表明大接骨丹葉醇提物間成分種類相似度較高，70%醇提物質(zhì)量整體穩(wěn)定、可控。詳見(jiàn)表3。

表3 10批大接骨丹葉醇提物指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Similarity evaluation results of 10 batches of ethanol extract from Toricelliae Intermediae Folium

聚類分析：以大接骨丹葉醇提物（編號(hào)為S1～S10）的11 個(gè)共有峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用質(zhì)心聚類法，以平方Euclidean 距離為測(cè)量度對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，當(dāng)平方Euclidean距離為25時(shí)，大接骨丹葉醇提物可分為2類，其中S1單獨(dú)聚為一類，S2 - S10 聚為第二類。聚類分析結(jié)果與樣本采集地密切吻合，表明大接骨丹葉醇提物受樣本采集地點(diǎn)影響相對(duì)較大，受土壤、陽(yáng)光、溫度、海拔等影響，不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)其質(zhì)量與二次代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生了一定影響。

圖4 大接骨丹葉醇提物聚類樹(shù)狀圖Fig.4 DendrogramofethanolextractfromToricelliaeIntermediaeFolium

主成分分析：將大接骨丹葉醇提物（編號(hào)為S1 -S10）的11 個(gè)共有峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，參考文獻(xiàn)［13］，以主成分特征值（λ）與方差貢獻(xiàn)率作為提取主成分的篩選指標(biāo)，進(jìn)行主成分分析。以λ＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果共得到2 個(gè)主成分，其中第一主成分λ為6.989，方差貢獻(xiàn)率為63.533%，貢獻(xiàn)最大；第二主成分λ為2.545，方差貢獻(xiàn)率為23.141%，貢獻(xiàn)次之。2 個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)86.674%，表明篩選得到的2個(gè)主成分涵蓋了大接骨丹葉醇提物HPLC指紋圖譜的大部分共有峰所代表的成分信息，HPLC 指紋圖譜篩選的共有峰可代表大接骨丹葉醇提物的整體成分信息。由圖5 可知，通過(guò)主成分分析提取的2 個(gè)主成分可代表大接骨丹葉醇提物的整體成分信息。由旋轉(zhuǎn)成分矩陣分析（表4）和載荷圖（圖6）可知，峰11，9，8，2，10，6，7在主成分1上的載荷絕對(duì)值最大；峰1、4（金絲桃苷）、3、5（異槲皮苷）在主成分2上的載荷絕對(duì)值最大。

表4 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Tab.4 Rotating component matrix

圖5 大接骨丹葉醇提物成分碎石圖Fig.5 Scree plot of components in ethanol extract from Toricelliae Intermediae Folium

圖6 旋轉(zhuǎn)成分載荷圖Fig.6 Loading plot of rotating component

3 討論

3.1 指紋圖譜研究

在后期開(kāi)展中藥、民族藥綜合開(kāi)發(fā)利用相關(guān)研究時(shí)，根據(jù)其所含化學(xué)成分，尤其是有效成分的極性，通常會(huì)選用水或一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑。本研究中結(jié)合大接骨丹葉所含化學(xué)成分，參考文獻(xiàn)［4-19］，以70%乙醇作為提取溶劑，并采用減壓干燥后的干膏粉制備供試品溶液，符合醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際。試驗(yàn)中構(gòu)建了10 批大接骨丹葉醇提物的HPLC 指紋圖譜［21-22］，確定了11 個(gè)共有峰，相似度為0.980～0.999，可聚為2類。

3.2 評(píng)價(jià)結(jié)果分析

通過(guò)指紋圖譜技術(shù)篩選出的共有峰能否成為代表藥材整體成分的信息庫(kù)，是評(píng)價(jià)指紋圖譜技術(shù)成功與否的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究中通過(guò)主成分分析，共得到2個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為63.533%和23.141%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)86.674%。試驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC 指紋圖譜篩選的共有峰可代表大接骨丹葉醇取物的整體成分信息。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的大接骨丹葉醇提物HPLC 指紋圖譜簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠、科學(xué)，可用于大接骨丹葉醇提物及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。