索尼婭石斛多糖亞臨界水提取工藝優(yōu)化研究*

王 娜，鄒愷平，劉 順，劉 煒△

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

石斛為蘭科石斛屬DendrobiumSw. 植物，其新鮮或干燥莖常被收作藥用。《神農(nóng)本草經(jīng)》將石斛列為上品，具有滋陰清熱、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用［1-2］。多糖類(lèi)成分是石斛屬植物的主要成分，具有促進(jìn)免疫和抗腫瘤作用［3-5］，常以多糖含量的高低來(lái)判斷石斛藥材質(zhì)量的優(yōu)劣［6］。目前，國(guó)產(chǎn)石斛屬植物由于生長(zhǎng)環(huán)境特殊、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、年生長(zhǎng)量有限、有性繁殖困難等因素，產(chǎn)量已遠(yuǎn)不能滿足中藥石斛藥材及復(fù)方制劑生產(chǎn)的原料供應(yīng)［7］。同時(shí)，石斛藥食同源，人們?cè)趶V泛使用過(guò)程中往往會(huì)忽略其潛在的毒副作用［8］。索尼婭石斛Dendrobium Sonia作為蘭科石斛屬人工培育品系，具有開(kāi)花時(shí)間長(zhǎng)、花多、枝長(zhǎng)、采后保鮮期長(zhǎng)等特點(diǎn)，但目前對(duì)其藥用價(jià)值和安全性的研究非常有限。前期研究中發(fā)現(xiàn)，索尼婭石斛多糖（DSP）具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性［9］。本研究中為了獲得高效的DSP 提取方法，優(yōu)化了亞臨界水提取工藝［10-13］，以期為DSP 成藥性提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AF - 16A 型粉碎機(jī)（溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司）；BP-211D 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；AX224ZH/E 型水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；FreeZone. 2.5 型凍干機(jī)（美國(guó)Labconco 公司）；Evolution 201 型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；亞臨界萃取機(jī)由南京林業(yè)大學(xué)提供；Direct-Q3型超純水機(jī)（德國(guó)Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

索尼婭石斛干燥莖（南京金陵藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20151103）；石油醚（60～90 ℃分析純，成都市科龍化工試劑廠）；無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；濃鹽酸（分析純，上海久億化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸、固體氫氧化鈉，均為分析純，購(gòu)于南京化學(xué)試劑股份有限公司；苯酚（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；D（+）-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為S08J6G1，純度≥98%）；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

藥材前處理：將索尼婭石斛干燥莖粉碎成粗粉，加6 倍量石油醚，浸泡2 h 脫脂后濾過(guò)，室溫放置樣品殘?jiān)瑩]干溶劑后置4 ℃冰箱，備用。

常規(guī)回流提取：稱(chēng)取藥材前處理項(xiàng)下樣品殘?jiān)?00 g，加20倍量溶劑進(jìn)行水提取（超純水）、酸提取（0.2 mol/L鹽酸）和堿提取（0.2 mol/L 氫氧化鈉），100 ℃加熱回流3 h，濾過(guò)。

亞臨界水提取：稱(chēng)取藥材前處理項(xiàng)下樣品殘?jiān)?00 g，加20 倍量超純水進(jìn)行亞臨界水提取（壓力為1.4 MPa，溫度為140 ℃），濾過(guò)。

2.2 多糖制備

取常規(guī)回流提取和亞臨界水提取項(xiàng)下濾液，調(diào)pH至6～7，加無(wú)水乙醇至醇濃度為80%，醇沉48 h，棄去溶劑得多糖沉淀，加水溶解，凍干（壓力為3.0 Pa，溫度為-40 ℃），即得多糖凍干粉末。

2.3 多糖含量與提取率測(cè)定

硫酸- 苯酚比色法測(cè)定多糖含量［14］：取葡萄糖對(duì)照品25.0 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL 容量瓶中，加超純水溶解并定容，搖勻，即得葡萄糖對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL）。分別精密吸取0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL葡萄糖對(duì)照品貯備液，置10 mL 容量瓶中，加超純水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為50，100，150，200，250，300 μg/ mL 的系列葡萄糖對(duì)照品溶液。分別精密量取各質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)照品溶液200 μL（空白樣品以等量超純水代替），置10 mL具塞試管中，分別加入超純水800 μL、5%苯酚溶液1 mL，沿試管壁迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩，搖勻，室溫下靜置20 min 至冷卻。于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 0.007 6X+ 0.128 2（r= 0.998 8，n= 6）。結(jié)果表明，葡萄糖對(duì)照品質(zhì)量濃度在50～300 μg/ mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

多糖提取率測(cè)定：收集各提取條件下多糖凍干粉末，分別溶解并定容至相同體積，即得多糖樣品溶液。采用硫酸-苯酚比色法［15］測(cè)定，按公式計(jì)算多糖提取率。多糖提取率（%）=（多糖濃度×提取液體積）/100×100%。由圖1 可知，亞臨界水提取法的DSP 提取率高于水提取多糖法。

圖1 不同提取方法的索尼婭石斛多糖提取率Fig.1 Comparison of extraction rates of Dendrobium Sonia with different extraction methods

2.4 DSP 亞臨界水提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取藥材前處理項(xiàng)下樣品殘?jiān)謩e考察不同提取溫度、液料比和提取壓力下的多糖提取率。由圖2可知，多糖提取率與提取溫度、液料比、提取壓力呈正相關(guān)；當(dāng)液料比大于30 mL / g 時(shí)，提取率升高趨于平緩。

2.4.2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)

因素與水平：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取壓力（C）為考察因素。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：稱(chēng)取藥材前處理項(xiàng)下樣品殘?jiān)?0 g，共17份，按表1 進(jìn)行試驗(yàn)，按2.3 項(xiàng)下方法測(cè)定多糖提取率。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the Box - Behnken response surface test

表3 Box-Behnken響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the analysis of variance of the Box-Behnken response surface fitting regression equation

A. 提取溫度與液料比 B. 提取溫度與提取壓力 C. 液料比與提取壓力圖3 各因素交互作用對(duì)索尼婭石槲多糖提取率影響的Box-Behnken三維響應(yīng)面圖A.Extraction temperature and liquid - to - material ratio B.Extraction temperature and extraction pressure C.Liquid - to - material ratio and extraction pressureFig.3 Three dimensional response diagram of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides fromDendrobium Sonia

結(jié)果分析：由表3可知，運(yùn)用亞臨界水提取模型分析各因素對(duì)提取工藝的影響合理（F=31.22，P＜0.000 1）。在本試驗(yàn)選擇區(qū)域范圍內(nèi)，提取溫度及液料比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖提取率均有極顯著影響（P＜0.01）。所得數(shù)據(jù)采用Design- Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，各因素經(jīng)回歸擬合后得回歸方程Y= 6.09 + 0.33A-0.069B+0.19C-0.36AB+0.16AC+0.27BC-0.41A2-0.59B2-0.72C2。根據(jù)所得模型，對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，可預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下的最大值Y為6.19%；以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，提取工藝優(yōu)化條件為提取溫度145 ℃、液料比25（mL/g）、提取壓力1.4 MPa。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取工藝條件，經(jīng)3 批樣品驗(yàn)證，多糖提取率分別為6.03%，6.14%，6.09%。結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

本研究中曾選擇不同水提取方法提取DSP，但提取率均不理想。參考文獻(xiàn)［16-17］，發(fā)現(xiàn)亞臨界水提取法的提取率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水提取法，且成本低、環(huán)保，故采用亞臨界水提取法進(jìn)行試驗(yàn)。推測(cè)是由于試驗(yàn)中隨著溫度的上升，水的介電常數(shù)降低，DSP 在水中的溶解度及物質(zhì)傳質(zhì)系數(shù)提高，提高了DSP 的擴(kuò)散速率［18］。以DSP提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇提取率較高的亞臨界水提取法，利用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)考察提取溫度、液料比、提取壓力對(duì)DSP 提取率的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為提取溫度145 ℃，液料比25（mL/g），提取壓力1.4 MPa。該工藝穩(wěn)定、可靠，可為工業(yè)化大生產(chǎn)的DSP提取提供參考。