Box-Behnken 響應面法結合信息熵法優化葛枳湯提取工藝*

鄭文麗，魏艷婷，李佳佳，趙玉斌，彭安堂

（1. 河北省石家莊市第二醫院，河北 石家莊 050051； 2. 河北省石家莊市第四醫院，河北 石家莊 050011；3. 河北省石家莊市人民醫院，河北 石家莊 050011； 4. 河北省石家莊市中醫院，河北 石家莊 050051）

葛枳湯由葛花、桑椹、枳椇子、決明子等藥味組方，具有解酒保肝、明目解毒功效［1-2］，臨床應用效果良好，故對其提取工藝進行優化，為其新劑型的開發和利用提供理論依據。Box - Behnken 響應面法可連續分析試驗的各個水平，減少試驗次數，還可考察影響因素間的交互作用，所得結果直觀、可靠［3］。本研究中對葛枳湯的4 種指標成分進行含量測定，在單因素試驗基礎上，運用Box- Behnken 響應面法優化提取工藝，以信息熵法賦予權重系數，計算綜合評分，優化響應面試驗結果，并進行驗證試驗，得最佳提取工藝?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD - 20A 型紫外檢測器；98 - 1B 型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；YP2002型電子天平（上海津平科學儀器有限公司，精度為10 mg）；TG328B型分析天平（上海精科儀器廠，精度為萬分之一）；RE-52 型旋轉薄膜蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；HCP-100 型高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）。

1.2 試藥

桑椹、葛花、枳椇子、決明子等中藥飲片均購自石家莊樂仁堂藥店，均經河北中醫學院侯芳潔副教授鑒定為正品；蘆丁對照品（批號為100080 - 200707，含量為90.5%），槲皮素對照品（批號為100081-201610，含量為99.1%），橙黃決明素對照品（批號為111900 -201605，含量為98.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；鳶尾苷對照品（成都普思生物科技有限公司，批號為F1180581，含量為98.0%）；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 水提液制備

按處方工藝稱取葛枳湯各組方中藥飲片，加8倍量水，浸泡0.5 h，補足吸水量，提取2 h，濾過，濾渣加8 倍量水，提取1 h，濾過，合并濾液，即得。

2.2 高效液相色譜法測定指標成分含量

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時5%A →15%A，10～17 min時15%A →19%A，17～27 min 時19%A，27～50 min 時19%A →40%A，50～70 min時40%A →50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數以鳶尾苷峰計不低于3 000，各色譜峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取各對照品適量，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素質量濃度分別為0.160，0.200，0.192，0.128 mg/mL 的單一對照品溶液，冷藏，備用。取上述單一對照品溶液各適量，加甲醇制成蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的質量濃度分別為48，80，36，1.95μg/mL的混合對照品溶液，冷藏，備用。

供試品溶液：取2.1 項下水提液，離心，取上清液，旋轉濃縮至每1 mL含1 g飲片量，取濃縮液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，充分振蕩使溶解，靜置5 min，取上清液，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取空白對照溶液（甲醇溶液）及2.2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有對應色譜峰，表明方法專屬性強。色譜圖見圖1。

1. 蘆丁 2. 鳶尾苷 3. 槲皮素 4. 橙黃決明素A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Rutin 2.Iridoid 3.Quercetin 4.Aurantio-obtusinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下單一對照品溶液各適量，分別用甲醇稀釋并定容，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各成分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察及檢測限與定量限確定結果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantification

檢測限與定量限確定：取2.2.2項下單一對照品溶液各適量，用甲醇逐級稀釋，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時的質量濃度為檢測限和定量限。結果見表1。

精密度試驗：精密量取2.2.2項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.68%，1.98%，1.96%，0.95%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取2.1 項下水提液適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.91%，1.76%，1.65%，1.94%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，分別于2，6，10，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素峰面積的RSD分別為1.28%，1.87%，1.31%，0.96%（n=5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密量取2.1項下已知含量的水提液1 mL，平行6份，分別按蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素含量的1∶1 加入對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按線性回歸方程分別計算各成分的含量，并計算加樣回收率。結果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的平均加樣回收率分別為99.88%，99.99%，99.93%，100.38%，RSD分別為0.29%，0.10%，0.48%，0.95%（n=6），表明方法準確度良好。

2.3 提取工藝單因素考察

粉碎粒度：按處方工藝稱取各中藥飲片3 份，進行飲片、粗粉、細粉3 種粉碎粒度處理，分別加入8 倍量水，浸泡0.5 h，提取2 次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液。根據指標成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權重［4］確定合理粉碎粒度。結果綜合評分隨飲片粉碎粒度減小而降低，粉碎粒度為飲片時綜合評分最高，故選擇粉碎粒度為原藥材飲片。詳見圖2 A。

A. 粉碎粒度 B. 浸泡時間 C. 加水量 D. 提取時間 E. 提取次數圖2 單因素試驗考察結果A.Crushing particle size B.Soaking time C.Water addition amount D.Extraction time E.Extraction timesFig.2 Results of the single factor test

浸泡時間：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，將飲片分別浸泡0，0.5，1.0，1.5，2.0 h，分別加入8 倍量水，提取2次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液。根據指標成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權重確定合理浸泡時間。結果綜合評分隨浸泡時間的延長先上升后下降，飲片浸泡0.5 h 時的綜合評分最高，故選擇浸泡時間為0.5 h。詳見圖2 B。

加水量：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，固定飲片浸泡0.5 h，分別加入6，8，10，12，14倍量水，提取2次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液。根據指標成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權重確定合理加水量。結果綜合評分隨加水量的增加先上升后下降，加8倍量水時的綜合評分最高，故選擇加8倍量水。詳見圖2 C。

提取時間：按處方工藝稱取各中藥飲片5 份，固定飲片浸泡0.5 h，加8 倍量水，分別提取1，2，3，4，5 h，提取2 次，即得水提液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液。根據指標成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權重確定合理提取時間。結果綜合評分隨提取時間的延長呈上升- 平緩- 下降趨勢，提取時間為3，4 h 時的綜合評分最高，考慮到實際生產，故選擇提取3 h。詳見圖2 D。

提取次數：按處方工藝稱取各中藥飲片3 份，固定飲片浸泡0.5 h，加8 倍量水，分別提取1 次、2 次、3 次，提取3 h，即得水提液，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液。根據指標成分蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的峰面積，通過信息熵權重確定合理提取次數。結果綜合評分隨提取次數的增加先上升后平緩，提取2次時的綜合評分最高，故選擇提取2次。詳見圖2 E。

2.4 響應面法優化提取工藝

2.4.1 試驗設計與結果

為提高試驗結果的嚴謹性與科學性，更客觀、準確地了解各成分在不同提取條件下的變化規律，減少主觀因素對試驗結果的干擾，在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，選取提取時間（因素A）、提取次數（因素B）和加水量（因素C）3 個重要影響因素為變量，以蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素的含量為評價指標，運用Box- Behnken 模型設計三因素三水平共17 個試驗點的響應面分析試驗［5］，其中12 個析因試驗、5個中心試驗。Box-Behnken試驗因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box - Behnken test

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the Box - Behnken test

2.4.2 信息熵法確定各指標權重系數及綜合評分［6］

根據公式（1）對表3 中4 個指標成分的含量的數據進行處理，建立原始評價指標矩陣（Xij）mn和概率矩陣（Pij）mn。根據公式（2）計算各指標成分的Hi，結果Hi=［0.985 8，0.969 8，0.978 5，0.962 8］；根據公式（3）計算各指標成分的權重系數Wi，結果Wi=［0.137 7，0.292 9，0.208 6，0.360 8］。根據公式M=（蘆丁含量/蘆丁含量max）×W1+（鳶尾苷含量/ 鳶尾苷含量max）×W2+（槲皮素含量/槲皮素含量max）×W3+（橙黃決明素含量/橙黃決明素含量max）×W4計算綜合評分，結果見表3。

2.4.3 模型建立與方差分析

經Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對表3 中的綜合評分進行多元擬合分析，得Y對提取時間（A）、提取次數（B）、加水量（C）3 個變量的二次多元回歸模型Y=12.124 - 3.014A- 0.664B- 1.768C+ 0.109AB-0.030AC+0.098BC+0.506A2-0.054B2+0.110C2。由表4可知，建立的回歸方程模型F=10.01，P=0.003 1 ＜0.05，表明此擬合模型差異有統計學意義；失擬項P=0.462 4 ＞0.05，差異不顯著，表明未知因素對結果干擾較小、試驗誤差小。故可判斷所建立的回歸模型具有參考性，可用于葛枳湯提取工藝的理論預測［7］。由F值可知，在各因素水平范圍內，對成分提取的影響程度由大至小排序依次為B ＞C ＞A，即提取次數＞加水量＞提取時間，其中提取次數和加水量有顯著影響（P＜0.05）。R2=0.927 9，R2adj=0.835 2，表明該模型可解釋83.52%響應值的變化。

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the analysis of variance

2.4.4 響應面分析及優化

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對表3 中的試驗結果作圖，固定某一因素，可得任意2 個因素交互作用對綜合評分影響的二維等高線圖和三維響應面圖［8］，詳見圖3?？梢?，因素AB 和BC 間的交互作用對綜合評分影響較強，因素AC 間交互作用影響較弱，交互項影響強弱順序為BC ＞AB ＞AC；提取次數（B）對綜合評分的影響最顯著，加水量（C）對綜合評分的影響較弱，提取時間（A）對綜合評分的影響所對應的曲面坡度為非線性，表明其對綜合評分的影響不顯著，與表4 回歸方程模型的顯著性檢驗結果一致。

A. 提取次數與提取時間 B. 加水量與提取時間 C. 加水量與提取次數圖3 各影響因素交互作用對綜合評分影響的二維等高線和三維響應面圖A.Extraction times and extraction time B.Water addition amount and extraction time C.Water addition amount and extraction timesFig.3 The 2D contour map and 3D response surface map of the interaction of various influencing factors on the comprehensive scores

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析得葛枳湯最優提取工藝為加9 倍量水，提取3 次，每次分別提取90，45，45 min。此優化提取工藝的綜合評分為0.981 9。

2.4.5 驗證試驗

按2.4.4 項下優化得到的提取工藝進行3 次驗證試驗，結果蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、橙黃決明素含量和綜合評分的RSD分別為0.17%，2.79%，4.45%，0.52%，0.82%（n=3），與預測值的差異不超過1%，表明所建立的模型預測性良好。故基于響應面法結合信息熵理論優化的提取工藝穩定可行，具有一定的實際應用價值。詳見表5。

表5 驗證試驗結果Tab.5 Results of the verification test

3 討論

3.1 指標成分選擇

葛枳湯化學成分復雜，單一成分作為含量測定指標不能很好地反映中藥復方的特點，且單一成分的含量在飲片和制劑中不一定相同，制劑中各成分可能相互影響，故選擇多成分作為含量測定指標評價葛枳湯的提取工藝具有一定科學性。

本研究中依據中藥處方的君臣佐使理論，選取主要有效成分進行含量測定，并通過信息熵法賦予各指標成分權重系數，得到綜合評分，所優選的工藝參數穩定、可靠?，F代藥理學研究表明，鳶尾苷作為君藥葛花的主要有效成分，對酒精代謝障礙及肝功能有改善作用，對酒精引起的臟器障礙及消化道功能障礙也有一定改善作用［9］；槲皮素為臣藥枳椇子的主要有效成分，對肝細胞的保護作用明顯，可減輕乙醇對肝組織的損傷［10］；蘆丁和橙黃決明素為佐使藥桑椹和決明子的主要有效成分，具有抗氧化、調血脂、保肝明目、降血糖等藥理作用［11-12］。故選取葛枳湯中鳶尾苷、槲皮素、蘆丁、橙黃決明素為指標成分對提取工藝進行優化，既可兼顧指標間的協同作用，又符合中醫用藥的整體觀念。

3.2 檢測波長選擇

對葛枳湯中的4個指標成分進行紫外光譜掃描，發現橙黃決明素、蘆丁、鳶尾苷、槲皮素分別在285，210，265，245 nm 波長處有最大紫外吸收。經試驗發現，于245 nm 波長處被測成分均能出峰，且蘆丁、橙黃決明素檢測靈敏度好，色譜峰峰形較好，各色譜峰分離度適中。為使各組分在同一波長下都能有較好吸收，達到吸收強、干擾小的目的，最終選擇245 nm作為檢測波長。

3.3 試驗方法選擇

本研究中首先進行單因素試驗考察，確定對結果產生主要影響的因素及水平，為響應面試驗設計提供參考；響應面試驗設計充分考慮各因素的交互作用，所得結果具有一定客觀性，且預測值與真實值較接近，可信度較好，試驗精確度較高［13］。信息熵理論能科學地賦予各指標權重系數，避免主觀因素對結果的干擾。驗證試驗可證實優選的提取工藝是否穩定、可行。故本研究中選擇在單因素試驗的基礎上，應用Box- Behnken 響應面法結合信息熵法優選提取工藝，并對優選的提取工藝進行驗證試驗，最終得到最佳提取工藝為飲片浸泡0.5 h，加9 倍量水，提取3 次，每次分別提取90，45，45 min。