反向離子對高效液相色譜法測定地夸磷索鈉含量

張小平，魏 淵，朱永星

（1. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇恒新藥業有限公司，江蘇 鎮江 212009）

干眼癥的發病原因包括淚液質和量異常，動力學異常的內膜穩定性下降，眼部神經異常，眼部炎癥導致角膜、結膜細胞損傷等，我國發病率為21%～30%［1］，且趨于年輕化、大眾化［2-3］。目前，治療干眼癥的常規方法是運用人工淚液或聯合抗炎藥物滴眼［4］，常用藥物有聚乙二醇［5］、普拉洛芬聯合玻璃酸鈉［6］、石斛夜光丸聯合玻璃酸鈉［7］、環孢素A［8］等。3%地夸磷索鈉滴眼液于2010 年在日本上市，2017 年10 月進入中國市場，臨床治療干眼癥療效良好［9-13］。地夸磷索鈉作用于眼結膜上皮及杯狀細胞膜上的P2Y2 受體，通過上調細胞內的鈣離子濃度，促進水分及黏蛋白的分泌，進而改善干眼癥癥狀，是一種治療干眼癥的新型藥物［14-17］。截至2022 年5 月25 日，國內尚無藥品生產企業取得地夸磷索鈉滴眼液批準文號，也無其含量測定的相關報道。本研究中采用反向離子對高效液相色譜法測定了地夸磷索鈉的含量［18］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP211D 型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；UV - 2600i 型紫外可見分光光度計，LC - 2030 Plus 型高效液相色譜儀，LC - 20 AD 型高效液相色譜儀，均購自日本島津公司；Agilent 1220 infinity LC 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；DL -204 型電熱恒溫干燥箱（天津市中環實驗電爐有限公司）；KQ-800DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 600 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

地夸磷索鈉對照品（廣東先強藥業有限公司，批號為211002，純度為99.8%）；地夸磷索鈉（批號分別為220301，220302，220303），純化水，均由江蘇恒新藥業有限公司自制；乙腈（德國默克集團）；磷酸二氫鉀、氫氧化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；四丁基硫酸氫銨（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo Scientific?C18柱（100 mm×4.6 mm，3μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）-乙腈（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：262 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取地夸磷索鈉樣品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加純化水適量，超聲（功率為1 600 W，頻率為40 kHz）20 min 使其徹底溶解，加純化水定容，搖勻，即得供試品溶液。取地夸磷索鈉對照品適量，置電熱恒溫干燥箱中干燥至恒重，取10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加純化水適量，超聲使溶解，加純化水稀釋并定容，即得對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2 項下對照品溶液、供試品溶液，以純化水為陰性對照品溶液，各10μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，結果對照品溶液在此色譜條件下的理論板數按地夸磷酸鈉峰計為6 237，拖尾因子為0.909。地夸磷索鈉理論板數不低于4 000，拖尾因子應不大于1.5，按外標法以峰面積計算。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰。色譜圖見圖1。

1. 地夸磷索鈉A. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Diauafosol sodiumA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

破壞性試驗：取地夸磷索鈉樣品100 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，按2.2 項下方法制備濃度為1 mg/mL的供試品溶液，平行6份，除1份溶液未經破壞外，其余溶液分別經強酸（2 mol/L HCl溶液、室溫3 h）、強堿（2 mol/L NaOH溶液、室溫3 h）、強氧化（3%H2O2溶液室溫3 h）、熱（100 ℃水溶0.5 h）、強光［（4 500±500）Lx照射1 d］條件破壞，破壞后，調pH至中性，加純化水衡釋為質量濃度為100μg/mL的溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果供試品溶液經酸破壞后峰面積減小，熱破壞后峰面積增大，對堿、氧化、強光破壞相對穩定，各降解產物均能較好分離，且對地夸磷索鈉主峰無干擾。

檢測限與定量限確定：取2.2 項下對照品溶液適量，加純化水逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3和10時待測成分的質量濃度作為檢測限和定量限。結果地夸磷索鈉檢測限為0.01μg/mL，定量限為0.03μg/mL。

線性關系考察：取地夸磷索鈉對照品0.032 36 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加純化水適量，逐級稀釋成質量濃度分別為3.23，32.30，161.50，323.00，484.50，646.00μg/mL 的系列溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。以地夸磷索鈉質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=11 346X+35 924（r=0.999 9，n=6）。結果表明，地夸磷索鈉質量濃度在3.23～646.00 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取地夸磷索鈉對照品適量，加純化水分別制成質量濃度為40，100，400μg/mL 的溶液，在日內各重復進樣5 次，并連續測定5 d。結果地夸磷索鈉低、中、高質量濃度的對照品溶液日內及內間精密度試驗結果的RSD均≤2.0%（n= 5）。取同一批（批號為220301）樣品適量，按2.2 項下方法配制成質量濃度為100μg/mL 的供試品溶液，在同一試驗室的不同時間，由不同操作人員分別用島津LC - 2030 Plus 型、Agilent 1220 infinity LC 型、島津LC-20 AD 型高效液相色譜儀測定樣品含量，結果中間精密度試驗結果的RSD為0.52%。上述結果表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為220301）適量，按2.2項下方法配制成質量濃度為100 μg/ mL 的供試品溶液，平行5 份，按2.1 項下色譜條件各進樣測定2 次，記錄色譜圖。結果地夸磷索鈉的平均含量為99.60%，RSD為0.36%（n=10），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為220301）0.010 05 g，精密稱定，按2.2項下方法配制成質量濃度為100μg/mL的供試品溶液，分別于室溫放置0，1，2，4，6，8，10，12 h時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果的RSD為0.69%（n= 8），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為220301）適量，共9份，分別置100 mL容量瓶中，分別加入質量濃度為0.401 0 mg / mL 的對照品溶液20，25，30 mL，各3 份，如純化水適量，超聲使溶解，加純化水定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果見表1。

表1 地夸磷索鈉加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of diauafosol sodium（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為220301，220302，220303）樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定2次，記錄峰面積，并計算含量。結果平均含量分別為99.84%，99.97%，99.35%，RSD分別為0.13%，0.06%，0.20%（n=2）。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

前期試驗中，取對照品10 mg，精密稱定，加純化水，制成每1 mL 溶液中含地夸磷索鈉50μg 的溶液，采用紫外分光光度計于200～400 nm 波長范圍內進行掃描。結果地夸磷索鈉溶液約在205 nm 及262 nm 波長處有最大吸收，由于205 nm 只檢測到該峰末端部分，屬紫外末端吸收，故檢測波長選擇262 nm。

3.2 色譜柱選擇

C18或C8反相色譜柱常用于分離弱極性、中性、非極性化合物，用C18或C8短柱（100 mm×4.6 mm，3μm）分離地夸磷索鈉，保留時間為1.0 min，換為長柱（250 mm×4.6 mm，5μm）保留時間僅延長至2.0 min，由于地夸磷索鈉顯極性，故在反相色譜柱中的保留時間極短。

3.3 磷酸鹽緩沖液配制方法選擇

地夸磷索鈉解離常數為6.3，在流動相為pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中以解離型居多，若選擇氫氧化鈉調節pH，溶液中的鈉離子會對藥物中的鈉離子形成干擾，降低含量測定的準確度，偏差變大；若將pH 調節劑換為氫氧化鉀，可避免外源性鈉離子對測定結果的干擾。地夸磷索鈉為弱酸類物質，流動相中需加入季銨類離子對（四丁基硫酸氫銨）［19］等正離子與藥物磷酸基團的負離子（反離子）生成不帶電荷的中性離子對，增加供試品在反相色譜柱中的溶解度，增大分配系數，改善分離效果，延長保留時間，實現樣品充分分離。故磷酸鹽緩沖液配制方法為取磷酸二氫鉀6.80 g，氫氧化鉀1.316g，四丁基硫酸氫銨5.0 g，加純化水1 000 mL，調pH 至6.8。同時發現，四丁基硫酸氫銨緩沖鹽溶液室溫放置8 h 以上可見渾濁，故需臨用現配。

3.4 流動相比例選擇

隨著流動相中乙腈濃度的增大，藥物出峰時間提前，保留時間變短，為了延長藥物在色譜柱中的保留時間，建議流動相中乙腈濃度不超過20%，故選擇磷酸鹽緩沖液與乙腈體積比為85∶15（V/V）。

3.5 進樣時間選擇

樣品連續進樣時間不宜過長，超過6 h，色譜峰逐漸漂移，峰形走樣變形，理論板數變小，拖尾因子變小；超過10 h，單峰變為雙峰，理論板數進一步變小，柱效下降，易導致泵和色譜柱損壞。故建議進樣時間控制在4 h內，試驗結束后需加倍延長沖洗色譜柱的時間。

3.6 方法評價

本研究中建立的方法專屬性強、結果準確，可為地夸磷索鈉原料藥及其制劑的研發提供質量評價依據，為其正式標準的擬訂提供參考。