山楂葉提取物對慶大霉素誘導大鼠急性腎損傷的影響及機制研究

豐姝姝,高旭杰,張珂,郭雪麗,陳雯艷,范雙雙,李國玉,王航宇*,王金輝, 2

(1 石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832002;2 哈爾濱醫科大學藥學院,黑龍江,哈爾濱 150081;3 深圳弘匯醫藥科技有限公司,廣東 深圳 518000)

急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是一種急性炎癥反應疾病,其特征是腎功能在7天或更短的時間內突然下降,是導致病情進展為慢性腎病的危險因素,具有高發生率和死亡率[1]。許多病因與AKI的病理生理過程有關,包括缺血再灌注損害、腎毒性藥物、內源性毒素或感染[2-3]。近年來,AKI的發病率呈逐年上升趨勢。據調查顯示,全世界每年大約有1300萬急性腎損傷患者,死亡人數也達到了170萬[4-5]。然而,迄今為止,還沒有針對AKI的特效藥物,因此,尋找有效的AKI治療方法備受關注。

山楂葉為薔薇科(Rasaceae)山楂屬(CrataegusL.)植物山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉。現代藥理學研究表明,山楂葉提取物有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6-8]。近年來,研究者們對山楂葉的關注大多集中于心血管疾病方面,但在腎損傷方面的研究很少[9-10]。周其其等[11]研究發現山楂葉類黃酮可通過抗氧化和抗炎作用緩解高脂血癥造成的腎損傷。因此,本研究探討山楂葉提取物對慶大霉素所致AKI大鼠的影響及作用機制,為山楂葉治療AKI的藥用前景提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場,體重220±20 g,動物質量合格證號:SCXK(豫)2019-0002。本實驗由石河子大學醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗儀器

N-1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司),TGL-16臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠),Therrno 3001全自動多功能酶標儀(美國Thermo),Axio Imager A蔡司正置熒光顯微鏡(北京博瑞斯科技有限公司),DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司),EC3510化學發光檢測成像系統(美國UVP公司)。

1.1.3 實驗試劑

山楂葉:采集于新疆林業科學院,鹽酸維拉帕米緩釋片(1127762):AbbVie Deutschland GmbH& Co.KG,硫酸慶大霉素注射液(01Y06011 C2):宜昌人福藥業,一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS,20210604)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX,20210608)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA,20210609)、總蛋白定量測定試劑盒(The total protein assay kit,20210610)、總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,20210609)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO,20210531)、溶菌酶(Lysozyme,LZM,20210604)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-glucosaminidase,NAG,20210416)試劑盒:南京建成生物工程研究所,P-ERK1/2抗體(BM5446):武漢博士德公司,P-p38 MAPK(4631S)、P-JNK(4668S)抗體:Cell Signaling technology公司,β-actin(TA-09)、山羊抗小鼠(127655)、山羊抗兔(129256)抗體:北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂葉提取物的制備

干燥山楂葉分別加入10倍量與8倍量的95%乙醇進行回流提取,每次提取時間為2 h,濾液濃縮成浸膏備用。

1.2.2 AKI動物模型

大鼠腹腔注射慶大霉素(100 mg·kg-1),連續7 d,于末次注射24 h后,大鼠眼眶靜脈叢取血,血清測定SCR和BUN含量,然后收集大鼠24 h內的尿液,測定LZM和NAG含量,判斷AKI模型是否建立成功。

1.2.3 動物分組及給藥

將AKI大鼠隨機分為模型組,山楂葉提取物低劑量組(0.5 g·kg-1),山楂葉提取物中劑量組(1 g·kg-1),山楂葉提取物高劑量組(2 g·kg-1)及陽性藥組(維拉帕米,15 mg·kg-1),空白組和模型組給予生理鹽水口服,其余組大鼠給予相應藥物溶液口服,連續14 d。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 腎體指數

實驗動物末次口服給藥24 h后,收集大鼠兩側腎組織,用生理鹽水沖去表面血漬,濾紙擦干,記錄重量,并計算腎體指數。

1.3.2 腎組織病理學

將固定于10%甲醛溶液48 h的腎組織浸入石蠟中,切片后,進行HE染色,使用光學顯微鏡拍照并觀察。

1.3.3 腎功能指標

實驗動物末次口服給藥24 h后,腹主動脈取血,離心制備血清,測定SCR和BUN含量。

1.3.4 炎癥因子

取大鼠右腎適量組織剪碎,加入預冷的生理鹽水,制成10%腎組織勻漿。在4 ℃下離心得上清液,按ELISA試劑盒操作說明書,測定IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量。

1.3.5 氧化應激水平

10%腎組織勻漿上清用于大鼠NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的測定。

1.3.6 腎組織P-p38 MAPK、P-ERK、P-JNK蛋白的表達

用RIPA裂解緩沖液(含0.1% PMSF)提取腎組織蛋白質。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白樣品,并將目的蛋白電轉到PVDF膜上。經封閉液封閉1.5 h,和P-p38(1∶800)、P-ERK(1∶1 000)、P-JNK(1∶1 000)的抗體在4 ℃下孵育過夜,然后與山羊抗兔抗體孵育1.5 h,滴加ECL試劑,UVP拍照,Image J軟件計算灰度值。

1.3.7 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠AKI模型的建立

與空白組大鼠相比,AKI大鼠尿液中LZM和NAG酶活性顯著升高(P<0.01),血清中BUN和SCR含量顯著升高(P<0.01)。表明已成功建立大鼠AKI模型(圖1)。

與空白組相比##P<0.01。圖1 AKI模型組大鼠尿液NAG、LZM水平及血清BUN、SCR水平

2.2 山楂葉提取物對AKI大鼠腎外觀和腎體指數的影響

實驗動物解剖取材后,觀察大鼠腎組織的外觀。模型組大鼠腎臟組織明顯腫大,并且泛白,經山楂葉提取物的處理后,腎腫大現象有所改善,并且顏色逐漸鮮紅。計算腎臟系數,如圖2所示,與空白組相比,模型組大鼠腎臟系數升高顯著(P<0.01),山楂葉提取物呈劑量依賴性地降低這種上升趨勢。以上結果說明,山楂葉提取物能夠改善AKI大鼠腎臟的腫大情況,從而保護腎臟。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組;與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05。圖2 山楂葉提取物對AKI大鼠腎外觀及腎體指數的影響

2.3 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織損傷程度的影響

為了確定山楂葉提取物是否對慶大霉素誘導的AKI有保護作用,我們檢查了大鼠腎臟組織的病理改變,結果如圖3所示。空白組大鼠腎小管細胞擺列緊密,腎小球、腎小管形態正常;模型組大鼠腎臟結構明顯被破壞,空泡增多,腎小管擴張,腎小管排列紊亂;與模型組相比,山楂葉提取物治療后大鼠腎損傷的組織學特征逐漸改善,其中山楂葉提取物高劑量組效果最好。

A: 空白組;B: 模型組;C: 山楂葉提取物低劑量組;D: 山楂葉提取物中劑量組;E: 山楂葉提取物高劑量組;F: 維拉帕米組。圖3 腎組織H&E染色(200×)

2.4 山楂葉提取物對AKI大鼠血清BUN和SCR的影響

通過測量大鼠血清BUN和SCR含量評估腎功能。結果如圖4所示,與空白組相比,模型組大鼠血清BUN和SCR含量升高,差異具有顯著性(P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物能呈劑量依賴性地降低BUN和SCR的含量,且中劑量和高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖4 山楂葉提取物對AKI大鼠血清中BUN(圖A)和SCR(圖B)的影響

2.5 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

AKI與全身和腎內炎癥有關,炎癥反應會降低腎功能,并促進晚期慢性腎病的發展。因此我們測定了炎癥因子的表達。結果如圖5所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,治療組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的含量均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),其中山楂葉提取物高劑量組顯著降低(P<0.01)。說明山楂葉提取物可以降低AKI大鼠炎癥因子水平,改善腎損傷。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖5 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α及KIM-1的影響

2.6 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織NO、MDA、SOD、NOS及GSH-PX含量的影響

結果如圖6所示,模型組大鼠腎組織NO、MDA、NOS含量顯著上升(P<0.01),SOD和GSH-PX含量顯著下降(P<0.01)。而山楂葉提取物治療后,與模型組大鼠比較,腎組織NO、MDA、NOS含量顯著下降(P<0.05或P<0.01),SOD和GSH-PX含量上升,高劑量組效果顯著(P<0.05或P<0.01)。因此,山楂葉提取物能夠通過抗氧化途徑來抑制AKI引起的氧化/抗氧化失衡。

與空白組相比##P<0.01;與模型組相比*P<0.05,**P<0.01。圖6 山楂葉提取物對AKI大鼠腎組織中NO、MDA、SOD、NOS、GSH-PX含量的影響

2.7 山楂葉提取物對大鼠腎臟P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達的影響

為了進一步探索山楂葉提取物在AKI中的作用機制,使用Western Blot試驗方法對P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達含量進行檢測。結果如圖7所示,與空白組相比,模型組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達水平顯著增加(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,山楂葉提取物組大鼠腎組織P-p38 MAPK、P-ERK1/2、P-JNK蛋白表達水平降低(P<0.05或P<0.01),且山楂葉提取物高劑量組和陽性藥組的蛋白表達量接近空白組。

3 討論

慶大霉素是一種強效氨基糖苷類抗生素,在臨床上主要用于治療革蘭氏陰性菌感染,但因為其能導致嚴重的腎毒性,因此限制了慶大霉素的臨床應用[12-13]。黃酮類化合物是山楂葉中的主要成分,對肝、腎損傷及心肌缺血具有保護作用,具有極高的研究價值[14]。本實驗通過建立AKI模型后給予山楂葉提取物口服給藥,以探討山楂葉提取物對慶大霉素所致AKI的影響。

慶大霉素引起的腎功能惡化表現為BUN和CR水平升高超過正常范圍,KIM-1和NAG的含量發生顯著變化。BUN主要經腎小球濾過,BUN的升高在一定程度上可以反應腎小球濾過功能的降低;實驗結果顯示,注射慶大霉素7 d后的大鼠尿液NAG、LZM含量及血清BUN、SCR水平較空白組相比,均顯著性升高,提示成功建立AKI大鼠模型,這與先前的研究一致。隨后AKI大鼠給予山楂葉提取物進行干預,病理學觀察顯示,空白組大鼠腎小管、腎小球形態正常;模型組大鼠腎小管擴張,腎組織結構破壞,損傷嚴重,且模型組大鼠血清BUN、CR含量較空白組顯著上升;山楂葉提取物低、中、高劑量組大鼠較模型組相比,腎組織損傷有所減輕,BUN和SCR含量降低,說明山楂葉提取物能夠改善腎組織病變,減輕慶大霉素導致的大鼠急性腎損傷。

氧化應激與慶大霉素誘導的腎毒性的發病機制密切相關。活性氧(ROS)的增加在慶大霉素引起的腎小管損傷的病理過程中扮演著重要的角色。當機體內氧化應激反應過強,不在機體的可調控范圍內時,過多的氧化物質會蓄積,導致各器官發生損傷。SOD和GSH是機體內重要的抗氧化防御系統成員,對機體維持氧化平衡有重要意義;而MDA是脂質過氧化代謝產物,可以間接反映機體的氧化應激水平[15-16]。同時,ROS的過度產生會導致炎性細胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α的表達增加[17]。與空白組相比,注射慶大霉素的大鼠腎臟中的MDA水平,NO和NOS含量顯著增加,而抗氧化酶(GSH、SOD)含量顯著降低。山楂葉提取物可拮抗這些改變,表明山楂葉提取物可改善慶大霉素誘導的氧化應激與炎癥反應。

先前的研究已表明MAPK通路與氧化應激、細胞凋亡和炎癥的調節顯著相關,且氧化應激可能會誘導MAPK信號通路的激活[18-19]。因此,抑制氧化應激和MAPK通路的藥物對AKI具有治療潛力。MAPK信號通路是細胞內信號傳導的重要途徑,參與調控了細胞的增殖、分化和凋亡等生理病理學過程,主要相關效應蛋白包括p38、ERK和JNK[20]。本研究發現,山楂葉提取物可以抑制p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平來減少細胞因子的產生,從而減弱慶大霉素誘導的炎癥損傷。

綜上所述,本研究表明山楂葉提取物能有效降低慶大霉素誘導的AKI大鼠的SCR和BUN水平,明顯減輕其腎臟病理損傷,通過抑制腎臟中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量來達到抗炎的作用,其保護機制可能與改善氧化應激,調控MAPK信號通路,下調P-p38 MAPK、P-ERK1/2和P-JNK的表達,從而減輕炎癥反應,改善腎損傷,但其具體分子作用機制需后續進一步研究。