葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78對順鉑治療舌鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

邱 波,王冠楠,谷艷嬌,黃克強(qiáng),蘇榮健,胡 靜

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界癌癥中排名第七[1-2]。舌鱗癌治療仍以手術(shù)切除原發(fā)病灶及頸部淋巴結(jié)清除術(shù)為主,并在手術(shù)前或手術(shù)后配合化療,以抑制腫瘤的生長以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。順鉑(cisplatin,DDP)是TSCC治療常用的化療藥物,而化療過程中耐藥細(xì)胞的出現(xiàn)可導(dǎo)致TSCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3-4]。舌鱗癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者5年生存率的重要因素,因此深入研究舌鱗癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)對舌鱗癌患者的預(yù)后具有重要意義。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)是一種多功能蛋白質(zhì),參與細(xì)胞分化、細(xì)胞生存、腫瘤血管形成、腫瘤發(fā)生進(jìn)展、腫瘤細(xì)胞免疫逃避、腫瘤化療的耐藥性等許多重要的細(xì)胞活動。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)GRP78可通過活化Src激酶來提高肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[5]。顧雪等[6]的研究證實(shí)GRP78通過MEK/ERK信號通路參與了卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。而GRP78在舌鱗癌中對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的影響少有報(bào)道,本研究首先通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測舌鱗癌細(xì)胞及舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞中GRP78的表達(dá)水平,然后利用RNA干擾技術(shù)敲減舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞GRP78表達(dá),進(jìn)一步研究GRP78對舌鱗癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要實(shí)驗(yàn)材料

舌鱗癌細(xì)胞株CAL27及舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞株CAL27DR由山東大學(xué)李敏啟教授贈送;DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,胎牛血清購自美國CLARK公司;GRP78、FAK、p-FAK、E-cad、N-cad、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、β-actin一抗購自美國Cell Signaling公司;DDP購自美國Sigma公司;Transwell小室購自美國Corning公司;BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司;轉(zhuǎn)染試劑購自中國百恩維生物科技有限公司,siGRP78質(zhì)粒購自中國吉?jiǎng)P基因公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期CAL27DR細(xì)胞,胰酶消化后將細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞密度生長至60%～70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞用不含抗生素的完全培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),分為對照組和siGRP78組,分別將空載體質(zhì)粒和siGRP78質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,按照PEI轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作,然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,每孔體積200 μL,24 h后0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 μmol/L DDP分別處理CAL27和CAL27DR細(xì)胞,0、2.5、5.0、10.0 μmol/L DDP分別處理對照和siGRP78CAL27DR細(xì)胞,48 h后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解,選擇490 nm波長,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值并記錄結(jié)果。

1.4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

胰酶消化對照和siGRP78細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液以2×104個(gè)/孔的數(shù)量接種于共聚焦培養(yǎng)皿,0、2.5、5.0、10.0 μmol/L DDP處理細(xì)胞,48 h后按照EdU試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn),共聚焦顯微鏡拍照分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

胰酶消化細(xì)胞后以1×105個(gè)/孔的數(shù)量接入6孔板,培養(yǎng)24 h后DMSO和DDP(5 μmol/L)分別處理對照和siGRP78細(xì)胞48 h,待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上后,用200 μL槍頭垂直于孔板底制造劃痕,確保各孔劃痕寬度一致,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)監(jiān)測細(xì)胞侵襲能力

DMSO和DDP(5 μmol/L)分別處理對照和siGRP78細(xì)胞48 h,胰酶消化細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105個(gè)/mL,50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面,24孔板的下室加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基,上室加入100 μL制備好的細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,然后用棉簽擦去表面未侵入細(xì)胞,甲醇固定10 min,0.3%結(jié)晶紫染色30 min,將小室風(fēng)干,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況,隨機(jī)選擇三個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)量,并求其平均值。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

胰酶消化對照和siGRP78細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/孔的數(shù)量接種于共聚焦培養(yǎng)皿,0、2.5、5.0、10.0 μmol/L DDP處理細(xì)胞,48 h后4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,0.5% TritonX-100處理10 min,BSA封閉30 min,Cortactin一抗4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,DAPI染色5 min,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況

收集CAL27和CAL27DR細(xì)胞,DMSO和DDP(5 μmol/L)分別處理對照和siGRP78細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,RIPA buffer 200裂解細(xì)胞,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,10% SDS-PAGE分離膠電泳,1% BSA封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜、洗膜、HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h,化學(xué)發(fā)光顯色液顯色,測定黏著斑激酶(focal adhsion kinase,FAK)、p-FAK、E-cad、N-cad、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、GRP78的表達(dá)。并使用Image J 10411軟件進(jìn)行量化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較采用t檢驗(yàn),P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞增殖能力升高

應(yīng)用DDP(0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 μmol/L)處理CAL27和CAL27DR細(xì)胞,48 h后采用MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示:隨著DDP濃度的升高,兩種細(xì)胞的增殖能力均逐漸降低,CAL27細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為2.5 μmol/L,而CAL27DR細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為7.5 μmol/L,與CAL27細(xì)胞相比,CAL27DR細(xì)胞增殖能力顯著升高(圖1)。

圖1 舌鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖能力升高

2.2 GRP78在舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞表達(dá)水平升高

應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測CAL27和CAL27DR細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:在CAL27和CAL27DR細(xì)胞中GRP78蛋白相對表達(dá)值分別為(0.88±0.02)、(1.19±0.03),兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

*:CAL27DR與CAL27細(xì)胞比較,t檢驗(yàn),P<0.05,GRP78表達(dá)水平顯著升高

2.3 GRP78對舌鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響

GRP78在DDP耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高,為了驗(yàn)證GRP78是否參與調(diào)控了舌鱗癌細(xì)胞對DDP的敏感性,我們利用RNA干擾技術(shù)在CAL27DR細(xì)胞中降低GRP78的表達(dá)水平(圖3),然后應(yīng)用DDP(0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)處理細(xì)胞,48 h后應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示(圖4A):對照組細(xì)胞增殖率分別為(100.00±0.00)%、(86.18±2.99)%、(66.01±7.40)%、(33.15±2.19)%,細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為7.5 μmol/L,siGRP78組細(xì)胞增殖率分別為(100.00±0.00)%、(65.35±2.40)%、(48.40±2.95)%、(23.52±2.62)%,細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為5 μmol/L,與對照組相比,siGRP78組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05),EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4B)與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明GRP78表達(dá)水平升高可能是舌鱗癌細(xì)胞對DDP敏感性降低的原因。

*:siGRP78與對照細(xì)胞比較,采用t檢驗(yàn), P<0.05

A:MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生存率;B:EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況( ×200);*:siGRP78與對照細(xì)胞比較,采用t檢驗(yàn),P<0.05

2.4 GRP78對舌鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示DMSO處理后對照組細(xì)胞遷移距離(41.83±4.20)μm,siGRP78組細(xì)胞遷移距離(22.67±2.82)μm,與對照組相比,siGRP78組細(xì)胞遷移距離顯著降低(P<0.05);DDP處理后對照組細(xì)胞遷移距離(33.13±2.93)μm,siGRP78組細(xì)胞遷移距離(11.82±0.40)μm,與對照組相比,siGRP78組細(xì)胞遷移距離顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明GRP78促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

*:siGRP78與對照比較,采用t檢驗(yàn),P<0.05

2.5 GRP78對舌鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示DMSO處理后對照組細(xì)胞侵襲數(shù)(404±15)個(gè),siGRP78組細(xì)胞侵襲數(shù)(227±13)個(gè),與對照組相比,siGRP78組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05);DDP處理后對照組細(xì)胞侵襲數(shù)(137±8)個(gè),siGRP78組細(xì)胞侵襲數(shù)(61±7)個(gè),與對照組相比,siGRP78組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

*:siGRP78與對照比較,t檢驗(yàn),P<0.05

2.6 GRP78對舌鱗癌細(xì)胞侵襲偽足形成的影響

為了探討GRP78促進(jìn)舌鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,我們應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測與細(xì)胞偽足形成有關(guān)蛋白Cortactin的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖7):與對照組相比,siGRP78組Cortactin的熒光強(qiáng)度顯著降低,這提示GRP78可參與調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞侵襲性偽足的形成。

圖7 GRP78對CAL27DR細(xì)胞Cortactin蛋白表達(dá)的影響( ×400)

2.7 GRP78對細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路激酶的影響

為了進(jìn)一步探索GRP78對細(xì)胞增殖及侵襲和轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制,我們應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)激酶的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:與對照組相比,siGRP78組ERK、AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化,而p-ERK、p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖8A),FAK蛋白表達(dá)水平無明顯變化,但p-FAK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),與EMT發(fā)生相關(guān)蛋白N-cad表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),E-cad表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖8B)。這些結(jié)果表明GRP78可能通過ERK及AKT信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖能力,并通過FAK激酶調(diào)控細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

A:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞ERK、p-ERK、AKT和p-AKT蛋白表達(dá);B:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞FAK、p-FAK、N-cad和E-cad蛋白表達(dá);*:siGRP78與對照比較,采用t檢驗(yàn),P<0.05

3 討 論

越來越多的研究表明GRP78的表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移和治療后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[7-10]。我們研究中發(fā)現(xiàn)GRP78在舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高,這提示舌鱗癌對DDP的敏感性降低可能與GRP78表達(dá)水平升高有關(guān)。為了進(jìn)一步研究GRP78的表達(dá)是否參與舌鱗癌DDP治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,我們在舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞中敲減GRP78后發(fā)現(xiàn)與對照組相比,GRP78敲減組細(xì)胞活力顯著降低,對DDP的敏感性升高,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對照組相比,GRP78敲減組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力也顯著降低。這表明GRP78表達(dá)水平升高是舌鱗癌DDP治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracelluar signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移方面起到重要作用和氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的重要組成部分[11-12]。PI3K/AKT通路是一條與細(xì)胞增殖、遷移、蛋白質(zhì)合成、血管生成、化學(xué)耐藥等多方面有關(guān)的重要通路,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用[13-14]。范麗梅等[15]的研究表明抑制GRP78表達(dá)能與DDP協(xié)同作用增加細(xì)胞凋亡的發(fā)生而逆轉(zhuǎn)卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性,其機(jī)制可能是通過影響AKT/mTOR信號通路的活性導(dǎo)致的。也有學(xué)者研究證明GRP78參與調(diào)節(jié)ERK激酶的活化并促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[16]。我們的研究也證實(shí)在舌鱗癌DDP耐藥細(xì)胞中抑制GRP78表達(dá)能與DDP協(xié)同顯著降低ERK、AKT激酶的磷酸化水平,這說明在舌鱗癌中GRP78可能通過ERK和AKT信號通路調(diào)控細(xì)胞對DDP的耐藥性。

有研究認(rèn)為鈣黏附蛋白N(N-cad)的異常表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示與對照組相比,敲減GRP78表達(dá)N-cad蛋白表達(dá)降低而E-cad蛋白表達(dá)升高,這表明抑制GRP78的表達(dá)可以協(xié)同DDP逆轉(zhuǎn)舌鱗癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。而細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而嚴(yán)密的過程,除了EMT的發(fā)生,還包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、黏著斑的形成、侵襲偽足形成等一系列復(fù)雜的過程。在腫瘤細(xì)胞中FAK是介導(dǎo)細(xì)胞黏著斑形成并調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動的關(guān)鍵因子,而β1-FAK-Rho GTPases通路在調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架運(yùn)動方面發(fā)揮重要的作用[18]。在我們的研究中敲減GRP78的表達(dá),FAK磷酸化水平顯著降低,因此我們推測GRP78通過FAK激酶調(diào)控了舌鱗癌細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附并促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動。為了進(jìn)一步探討GRP78對細(xì)胞侵襲偽足形成能力的影響,我們應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Cortactin的表達(dá),結(jié)果顯示與對照組比較,GRP78敲減組Cortactin的表達(dá)水平顯著降低。

綜上所述,GRP78通過ERK、AKT激酶上調(diào)細(xì)胞的增殖能力,導(dǎo)致舌鱗癌細(xì)胞對DDP的敏感性降低,同時(shí)GRP78介導(dǎo)了舌鱗癌細(xì)胞EMT的發(fā)生并通過活化FAK激酶促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力升高。因此在舌鱗癌DDP治療過程中,可以將GRP78作為聯(lián)合用藥的新靶點(diǎn)。