銅離子對牙髓組織再生能力的影響及其機制初探

伍 玉,楊磊婷,江 飛,周芷萱,沈 銘

不可復性牙髓炎是口腔臨床常見問題。由于被無讓性的牙本質包繞,牙髓組織難以通過有效側支血供自我修復,炎癥牙髓只能被摘除以保存患牙[1]。然而,根管治療后的牙體組織會因失去牙髓滋養而出現易折、易變色、牙根發育停止(年輕恒牙)等并發癥[2]。因此,組織工程牙髓再生成為研究熱點[3-4]。來源于神經嵴的牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有很強的細胞增殖能力及多向分化潛能[5-6],是牙髓組織再生應用中理想的種子細胞。

色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7,CBX7)為多梳抑制復合物1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的關鍵亞基,是參與細胞周期調控的轉錄抑制因子[7]。低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)能直接結合cbx7啟動子區、內源性上調CBX7,通過HIF-1α-CBX7級聯效應促進干細胞自我更新、維持干細胞特性[8]。有研究證實,銅離子是人體內具有生物活性的微量元素,能通過模擬乏氧環境,在刺激細胞活化HIF-1α的同時,還能大量分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導血管新生[9]。本文主要探討銅離子能否在DPSCs中通過活化HIF-1α增加CBX7的表達和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的分泌,進而在牙髓組織再生過程中發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗動物 本研究使用5只8周齡的雄性BALB/c裸鼠,由南京醫科大學實驗動物中心提供(飼養協議編號:SY20200050)。動物的使用經南京醫科大學動物護理和使用委員會批準(動物實驗倫理編號:IACUC 2005034-1)。

1.1.2 實驗試劑與儀器 α-MEM培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(Gibco,美國),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Cellmax,美國),磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)、ECL發光底物(Biosharp,中國),CCK-8試劑盒(同仁,日本),Fibrinogen(Sigma,美國),Calcein-AM/PI活死細胞雙染試劑盒(翊圣,中國),高純總RNA快速提取試劑盒(百泰克,中國),HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊,中國),蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(APExBIO,美國),PVDF轉印膜(Millipore,美國),HIF-1α一抗、CBX7一抗、Sox-2一抗、GAPDH一抗(Proteintech,美國),Oct-4一抗、Nanog一抗(Abcam,英國),ECM培養基(Sciencell,美國),matrigel matrix(Corning,美國),檸檬酸緩沖液干粉(Coollaber,中國)。多功能酶標儀(Tanon,中國),化學發光凝膠成像系統(Tanon,中國),ABI熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,英國),正置熒光顯微鏡(Leica,德國)。

1.2 細胞來源及培養

DPSCs從15～25周歲年輕人需要拔除的前磨牙牙髓或阻生牙牙髓中獲取(倫理審批號No.2021-177,南京醫科大學)。渦輪機磨切牙頸部,在超凈臺中用拔牙鉗掰開牙齒,用拔髓針拔出冠髓、根髓并置于培養皿中。用含有10%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的PBS沖洗牙髓組織3遍,并剪碎牙髓組織。蓋玻片四角抹蘸滅菌凡士林后,將已剪碎的牙髓組織壓于新培養皿底。培養皿中加入α-MEM完全培養基,于37 ℃,5% CO2的孵箱中靜置1周,待細胞從組織中爬出。原代DPSCs爬出后,每48～72 h換1次液,按正常細胞培養方式培養、傳代。

1.3 CCK-8法測定細胞增殖

稱取63.93 mg CuCl2·2H2O,用15 mL ddH2O溶解,0.22 μm的濾器過濾,分裝,4 ℃冰箱保存,使用時用完全培養基稀釋至相應的濃度即為含銅離子的完全培養基。在96孔板中接種第3代DPSCs懸液100 μL(2×103個細胞/孔)。細胞貼壁后換成含5、25、50、100、200 μmol/L銅離子的完全培養基,Control組不含銅離子。將培養板放在孵箱中培養1、3、7、14 d。到相應時間點時,避光環境下向相應孔中加入10 μL CCK-8溶液,培養箱內孵育2 h后用酶標儀測定450 nm處的光密度值。

1.4 水凝膠毒性檢測

用PBS配制終質量濃度為5 mg/mL的人來源Fibrinogen溶液,并用0.22 μm的濾器過濾后備用。按每100 μL體系用1 μL 50 U/mL的凝血酶將Fibrinogen催化后,均勻鋪在24孔板底部,每孔500 μL。待膠凝固后用含5、25、50 μmol/L銅離子或不含銅離子的完全培養基按1.5×104個/孔接種DPSCs細胞懸液500 μL,每2～3 d換1次液,培養14 d后根據Calcein-AM/PI活死細胞雙染試劑盒說明書操作步驟操作并于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.5 Western blotting檢測

第3代DPSCs以2.5×105個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁后更換含5、25、50 μmol/L銅離子的完全培養基,培養7 d和14 d后用RIPA緩沖液與蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物配制的裂解液提取細胞總蛋白。使用10% SDS-PAGE凝膠分離總蛋白(10 μg)后,將其轉移到PVDF膜上,然后在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,HIF-1α一抗(稀釋比例1∶1 000)、CBX7一抗(稀釋比例1∶1 000)、Sox-2一抗(稀釋比例1∶3 000)、Oct-4一抗(稀釋比例1∶1 000)、Nanog一抗(稀釋比例1∶1 000)和GAPDH一抗(稀釋比例1∶1 000)孵育過夜。第2天將PVDF膜置于TBST溶液搖床5 min,3次后放到相應二抗溶液中室溫孵育1 h(二抗使用TBS溶液1:10 000稀釋),最后滴加ECL發光底物顯示蛋白質條帶。通過Image J軟件計算條帶的強度。

1.6 實時定量PCR(qPCR)

細胞接種同上,培養7 d和14 d后按照高純總RNA快速提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,然后按HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR說明合成cDNA。ABI熒光定量PCR儀檢測cDNA用來分析與干細胞特性、血管生成相關的mRNA表達情況。本研究使用的引物序列如表1所示,β-Actin用作內參。

表1 引物序列

1.7 人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成管實驗

將第3代的DPSCs以1×106個/mL密度接種于10 cm2培養皿中,待細胞貼壁后更換為含5、25、50 μmol/L銅離子的完全培養基,待細胞匯合度達80%左右時,換成無血清的α-MEM基礎培養基,24 h后吸出培養液制備DPSCs條件培養基。第1天將matrigel由-20 ℃取出,放入4 ℃冰箱過夜。第2天將matrigel置于冰上,槍頭盒及96孔板也提前置于冰盒上預冷。每孔加入50 μL matrigel,并在37 ℃孵箱中放置30 min。胰酶消化并用ECM完全培養基重懸HUVECs。實驗組使用80% DPSCs條件培養基將細胞濃度調整到3×104個/孔接種于96孔板,每孔100 μL;對照組使用80% α-MEM基礎培養基稀釋細胞,每組重復3孔。37 ℃孵箱孵育,每3 h在倒置顯微鏡下觀察一次成管情況并拍照,使用Image J測量小管節點數及分支長度,并統計分析。

1.8 HUVECs遷移實驗

24孔板下室以2×104個/孔接種第3代DPSCs,貼壁后更換含5、25、50 μmol/L銅離子的完全培養基,待匯合度達80%時接種5×103個/孔HUVECs于24孔板transwell小室的上室。HUVECs在制備細胞懸液前先讓細胞撤血清饑餓24 h,去除血清的影響。消化細胞,終止消化后離心棄培養液,用無血清ECM培養基重懸。常規培養24～48 h后取出小室,4%多聚甲醛固定小室底面15 min,PBS洗3遍。結晶紫染色5 min后用超純水洗去多余染色劑,干燥后正置顯微鏡下拍攝,統計分析。

1.9 負載DPSCs的含銅離子水凝膠體內生物學性能檢測

將大皿中的DPSCs消化后調整細胞密度至9×106個/mL,與10 mg/mL Fibrinogen溶液按1∶1比例進行預混,以每100 μL體系加入1 μL 50 U/mL的凝血酶催化Fibrinogen溶液,在未成膠前注射于裸鼠背部皮下。實驗組分為2組,分別為:①DPSCs/水凝膠組;②DPSCs/銅離子水凝膠組,含25 μmol/L銅離子。于術后14 d取材,通過蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)和免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色檢測細胞的自我更新和血管新生情況。

1.10 IHC染色

安樂死實驗鼠后取出皮下細胞團塊,標本經10%甲醛固定24 h后,流水沖洗4 h,乙醇脫水,將樣品石蠟包埋并以5 μm的厚度切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后,放入1×檸檬酸鹽緩沖溶液中水浴加熱10 min,室溫冷卻。用3% H2O2處理切片15 min以去除內源性過氧化氫酶,山羊血清封閉1 h,然后滴加適量一抗,置于濕盒中4 ℃孵育過夜。第2天將切片在PBS中洗滌3次,并根據一抗滴加相應二抗,室溫孵育20 min,DAB顯色,最后蘇木素染核,脫水封片。正置顯微鏡下拍攝后,Image J統計陽性區域。

1.11 統計學分析

采用兩個獨立樣本t檢驗和單因素方差分析實驗數據,所有統計分析均使用GraphPad Prism 9軟件進行。所有實驗均重復3次及以上,結果以平均值±標準差(SD)表示,P<0.05認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度銅離子對DPSCs的毒性檢測

為了檢測不同濃度銅離子對DPSCs的毒性,將第三代DPSCs在不同濃度的銅離子中培養1、3、7、14 d后通過CCK-8檢測細胞毒性,結果顯示濃度為100 μmol/L和200 μmol/L時DPSCs增殖呈現比較明顯的抑制,提示可能濃度過高存在毒性。與對照組比較,5、25、50 μmol/L對DPSCs無顯著毒性作用(圖1A)。同時,在含銅離子水凝膠培養體系中,與含銅離子濃度為5、25、50 μmol/L銅離子的水凝膠接觸培養的DPSCs存活良好,與對照組凝膠中細胞狀態無差;經過14 d培養,水凝膠基本完全降解,細胞貼壁生長(圖1B、C)。

A:CCK-8檢測不同濃度銅離子對DPSCs的毒性作用;B、C:含5、25、50 μmol/L銅離子的水凝膠接觸式培養DPSCs 14 d后活細胞(綠色)與死細胞(紅色)染色及統計情況( ×100);與Control組相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.2 銅離子刺激DPSCs后HIF-1α、CBX7的表達情況

Western blotting和qPCR技術檢測質量濃度為5、25、50 μmol/L的銅離子在刺激DPSCs 7 d和14 d后HIF-1α和CBX7的表達水平,結果顯示銅離子能夠激活DPSCs中的HIF-1α,上調內源性CBX7,其中銅離子質量濃度為25 μmol/L時,激活HIF-1α、上調CBX7效果最明顯(圖2A～E)。

A～C:Western blotting檢測DPSCs中HIF-1α和CBX7的蛋白表達水平;D～E:qPCR檢測DPSCs中HIF-1α和CBX7的mRNA表達水平;與Control組相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.3 銅離子刺激DPSCs上調CBX7后,干細胞特性指標的表達情況

通過Western blotting和qPCR檢測經5、25、50 μmol/L質量濃度的銅離子刺激后干細胞特性相關基因的蛋白和mRNA在DPSCs中的表達情況,結果顯示銅離子誘導7、14 d能夠促進DPSCs中CBX7表達,上調Sox-2、Oct-4、Nanog,且銅離子濃度為25 μmol/L時DPSCs的干細胞特性指標上調最顯著(圖3A～G),這表明合適濃度的銅離子能夠促進DPSCs干細胞特性的維持。

A～D:Western blotting檢測DPSCs中Sox-2、Oct-4和Nanog的蛋白表達水平;E～G:qPCR檢測DPSCs中Sox-2、Oct-4和Nanog的mRNA表達水平;與Control組相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.4 銅離子刺激DPSCs后成血管表型變化

為了研究銅離子刺激DPSCs后對HUVECs血管形成有無促進作用,我們檢測了DPSCs中VEGFA的基因表達情況, 結果顯示25 μmol/L銅離子刺激的DPSCs中VEGFA表達最高(圖4B)。考慮到DPSCs分泌的VEGFA可能增強促血管生成潛能,我們隨后進行了血管形成實驗。觀察到25 μmol/L銅離子組中成管作用最顯著(圖4A、C、D)。當將25 μmol/L銅離子刺激下的DPSCs與HUVECs共培養24 h和48 h后,HUVECs遷移穿過transwell膜的數量也最多(圖4E、F)。這些結果表明銅離子除維持DPSCs干性的同時,還可激活DPSCs發揮促血管化旁分泌作用。

A,C,D:銅離子刺激后的DPSCs條件培養基對HUVECs成管能力的影響( ×40);B:qPCR檢測DPSCs中VEGFA的mRNA表達水平;E,F:DPSCs與HUVECs共培養24 h、48 h后HUVECs的遷移情況( ×100);與Control組相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

2.5 負載DPSCs的含銅離子水凝膠的初步生物學性能驗證

為了體內驗證含銅離子水凝膠的生物學性能,在裸鼠皮下分別注射負載DPSCs的含25 μmol/L銅離子或不含銅離子水凝膠,14 d后可見注入物與周圍組織相容性良好、注入物內部凝膠降解完全。含銅離子組材料內部出現新生血管樣組織,且組織內干細胞特性指標Sox-2的陽性細胞比例顯著增加(圖5)。初步實驗結果顯示含銅離子水凝膠具有良好的生物相容性和降解性,能夠維持被移植的DPSCs干細胞特性;促進DPSCs發揮促血管化旁分泌作用,誘導局部組織快速血管化。因此,含銅離子水凝膠作為支架材料對于血管化的功能性牙髓組織再生具有一定可行性。

注射負載 DPSCs 的銅離子水凝膠14 d后取樣時大體圖、石蠟切片HE染色( ×50)及SMA、Sox-2免疫組化染色( ×400);①DPSCs/水凝膠組;②DPSCs/含銅離子水凝膠組;與Control組相比,***:P<0.001

3 討 論

牙髓組織在牙齒的礦化和敏感性維持中發揮重要作用[10]。但常規的根管治療由于去除了炎癥牙髓組織,進而導致由牙齒內環境平衡的破壞[11]。因此,牙髓再生對于恢復牙齒活力至關重要。有研究將體外收集、擴增形成的自體DPSCs細胞聚集體植入外傷性年輕恒切牙根管中,發現DPSCs細胞聚集體在無支架材料的條件下原位再生牙髓組織,恢復部分牙髓功能,促進根尖發育[12]。但該研究對象為年輕恒切牙,其根管相對較粗、根尖孔未閉合,易于細胞聚集體的植入和血運重建,而從成人牙髓組織分離獲得的DPSCs中只有少部分具有很強的細胞增殖能力及分化潛能,且較難維持干細胞特性。同時,發育正常的恒牙根管相對較細,其根尖孔作為牙髓唯一的血供來源直徑為0.20～0.63 mm[13],這一解剖因素不利于種子細胞的植入以及血運重建。因此,在本研究中,我們提出了一種優化策略,使用可注射的含銅離子水凝膠作為DPSCs的牙髓遞送載體,不僅可以維持移植的DPSCs保持良好干細胞特性,還可以快速地誘導根尖孔至根管內的血運重建,最終重建牙髓組織正常生理功能。

銅離子具有較強的促進血管新生的作用[14]。其通過激活HIF-1α和增加VEGF的分泌,顯著增強缺氧樣反應,對人骨髓基質細胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)具有明顯的促進血管新生作用等[9]。在我們的實驗中,25 μmol/L濃度的銅離子可在體外上調DPSCs中HIF-1α的表達,進而使VEGFA的表達水平增高。相應地,血管生成實驗表明,銅離子刺激DPSCs分泌的VEGFA增強了HUVECs的血管生成潛能,與對照組相比,銅離子刺激的DPSCs的條件培養基可以強烈募集HUVECs。這一結果表明銅離子能促進DPSCs發揮促血管化的旁分泌作用,銅離子與DPSCs誘導的微環境有利于血運重建。

干細胞提取、培養、移植會刺激干細胞分化,如何維持DPSCs的干細胞特性,從而再生出具有良好生理功能牙髓組織,是牙髓再生的難點。大量研究表明,CBX7在維持干細胞特性方面具有重要意義。在小鼠胚胎干細胞中,CBX7的高表達能夠上調干細胞中的Sox-2、Oct-4和Nanog[15],這些多潛能轉錄因子在胚胎干細胞和成體干細胞的自我更新和干細胞特性維持中發揮關鍵作用[16-17],同時這些轉錄因子還可誘導多能性干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成,維持細胞全能性[18];在成體多能樣嗅覺干細胞亞群(adult olfactory cell population,APOSCs)中,cbx7+/+APOSCs對自發性或損傷性誘導的組織再生反應迅速,而cbx7-/-APOSCs自我更新和分化潛能受損[19];在人正常和惡性造血干細胞中,CBX7表達增加并整合入PRC1聚合物時會加快細胞自我更新甚至誘發白血病[20];在胃癌干細胞中,CBX7通過抑制p16表達、同時激活蛋白激酶B/核因子κB(Akt/NF-κB)上調miR-21,增加胃癌細胞干細胞樣特性[21]。為了驗證銅離子刺激DPSCs后是否也能增加CBX7的表達,維持DPSCs干細胞特性,以利于功能性牙髓組織再生,我們通過Western blotting和qPCR檢測CBX7、Sox-2、Oct-4和Nanog在體外的表達情況,結果顯示25 μmol/L銅離子可以在體外上調DPSCs的CBX7,增加Sox-2、Oct-4和Nanog的表達。因此,我們認為銅離子除激活DPSCs發揮促血管化旁分泌作用的同時,還可維持DPSCs的干細胞特性,達到提升DPSCs再生潛能的效果。

成熟恒牙根管的三維空間結構狹窄復雜,很難重建血液供應。根尖孔較大的年輕恒牙被認為是可能進行牙髓再生的牙齒類型。然而有研究表明當根尖孔縮窄至1 mm,根管長度縮窄至11 mm時,包裹有促血管生成因子的可注射支架可幫助實現完全的牙髓血管化再生[22]。我們課題組曾用纖維蛋白水凝膠立體培養人胚胎羊膜干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs),并將負載hAMSCs的纖維蛋白水凝膠植入兔上頜竇提升區、顱頂骨缺損區,均獲得局部相應組織再生[23-24]。與二維平面培養相比,水凝膠構建的立體培養體系能模擬細胞體內生長微環境,維持細胞活性,還能類似胞外基質支撐微血管形成[14]。為了既方便DPSCs遞送,又可負載水溶性銅離子,并能構建可維持DPSCs干細胞特性的血管化微環境,我們在先前研究的基礎上,制備了具有一定流動性的負載DPSCs的含銅離子水凝膠材料并注射至裸鼠皮下14 d,結果發現水凝膠被完全吸收,并且在負載DPSCs的含銅離子水凝膠中觀察到SMA和Sox-2陽性染色的細胞明顯增多。因此,基于我們細胞及體內研究的結果,我們初步明確了負載DPSCs的含銅離子水凝膠可在促牙髓組織再生中發揮重要作用,雖然未達到原位牙髓再生的效果,且再生表型還有待在大型動物的根管模型內進一步驗證,但這也為臨床促進牙髓再生提供了新思路。

綜上所述,本研究初步驗證了銅離子刺激DPSCs活化乏氧信號HIF-1α后,一方面能使CBX7表達水平升高,進而上調Sox-2、Oct-4和Nanog,維持DPSCs干細胞特性,獲得具有分化潛能的牙髓組織;另一方面能促進VEGFA分泌,誘導血管新生,促進新生組織快速血管化。同時通過體內實驗初步驗證了負載DPSCs的含銅離子水凝膠的生物學性能,為再生功能性牙髓組織提供理論和實驗依據。