鉭涂層對hPDLSCs增殖及成骨分化的影響

葛 瀟,于 淼,武 偉,畢秀婷,吳小燕,于 晨,李 倜

鉭(Tantalum,Ta)是一種新興的金屬生物材料,其機械性能及生物學性能優于鈦和鈦合金,在修復骨缺損方面得到廣泛應用,有潛力成為鈦及鈦合金的替代材料[1-3]。鉭的密度較大,價格昂貴,因此臨床上金屬鉭多以涂層的形式用于種植體表面改性[4]。等離子噴涂技術因其適用范圍廣、工藝參數可控、制備流程簡單等成為種植體表面涂層制備的常用方法[5]。有研究表明,在噴砂酸蝕(sandblasted,large-grit,acid-etched,SLA)處理的鈦種植體表面用等離子噴涂技術制備的鉭涂層結合緊密且具有多孔結構,且生物相容性較鈦種植體更好[6-7]。細胞在材料表面的表現是獲得良好骨整合的關鍵,決定了骨植入物的長期穩定性和成功率[8-9]。人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)是一種具有多向分化能力的成體干細胞,且獲取方式簡單、微創,其成骨潛能對種植體周圍的骨形成具有重要意義。本研究在SLA鈦金屬表面通過等離子噴涂技術制備鉭涂層,并在其表面培養hPDLSCs,以探究鉭涂層表面對hPDLSCs增殖和成骨分化的作用,為鉭涂層鈦種植體的臨床應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

純鈦片、鉭粉、胎牛血清(Gibco,美國)、DMEM培養基(Gibco,美國)、胰蛋白酶(Gibco,美國)、CCK-8試劑盒(Dojindo,日本)、茜素紅染液(Solarbio,中國)、油紅O染色試劑盒(Beyotime,中國)、BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio,中國)、ALP/AKP測定試劑盒(南京建成,中國)、Trizol試劑(Ambion,美國)、反轉錄試劑盒、SYBR qPCR Mix試劑盒(艾科瑞生物,中國)、引物(上海生工,中國)、小鼠抗人抗體(biolegend,美國)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(TM4000Plus,HITACHI,日本)、體視顯微鏡及倒置顯微鏡(Leica,德國)、流式細胞儀(Agilent,美國)、酶標儀(Thermo,美國)、PCR儀(BIO-RAD,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鈦試件的處理、分組及表征 ①將純鈦片用SiC砂紙逐級拋光得到表面光滑的鈦試件,命名為P組;②將經過拋光的試件進行噴砂(噴砂粒徑400～600 μm,噴砂壓力0.4 MPa,噴砂角度45°)、酸蝕(混合酸溶液:49% HCl和19% H2SO4,60 ℃,30 min)處理,命名為SLA組;③用丙酮、無水乙醇、去離子水依次對經SLA處理的試件超聲清洗3 min,然后在鈦試件表面用PRAXAIR3710等離子噴涂系統制備鉭涂層,命名為Ta組,具體噴涂參數如下:噴涂距離110 cm,電流820 A,電壓37 V,噴槍移動速度100 mm/s,送粉速度15 g/min,涂層厚度100 μm左右。用SEM觀察SLA組、Ta組的試件表面和Ta組的截面,用能譜分析儀(energy dispersive spectrometer, EDS)對其主要成分進行分析。

1.2.2 hPDLSCs的分離培養 實驗經濰坊市人民醫院倫理委員會批準(審批號KYLL20191114-2),取2021年10月16日—2021年11月27日臨床上無齲病、無牙周病的12～18歲患者正畸需拔除的前磨牙,立即置于含有5%青/鏈霉素的PBS液中,2 h內在超凈工作臺上完成牙周膜分離操作。用無菌PBS液(含5%青/鏈霉素)反復沖洗離體牙,無菌刀片刮取牙根中段的牙周膜組織,分成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊,平鋪在25 cm2的培養瓶底,加入含有20%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養液4～6 mL。放入培養箱中(37 ℃,5% CO2),瓶底向上培養3～4 h后,翻轉培養瓶。顯微鏡下觀察,待有細胞游出后,每3 d更換培養基。當細胞生長至約80%融合時,用胰蛋白酶消化進行傳代。將第3代細胞進行凍存,在后續的實驗中使用。

1.2.3 hPDLSCs的鑒定 ①流式細胞術檢測表面抗原:取1.2.2部分培養的第3代細胞,消化后PBS洗滌3遍,使細胞懸液密度為4×105個/mL,并向每個管加入250 μL細胞懸液,其中1管為空白對照,其余分別添加CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105抗體,避光孵育,PBS洗滌3遍,上機檢測。②成骨、成脂分化能力檢測:取第3代hPDLSCs,以每孔1.5×105個的密度接種于6孔板中,待細胞貼壁后,更換成骨誘導培養基(含抗壞血酸0.05 mmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、地塞米松1×10-7mol/L)培養21 d后棄去培養液,PBS沖洗,多聚甲醛固定,用茜素紅染色液染色。用成脂誘導培養基(含3-異丁基-1-甲基嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L、胰島素10 mg/L、地塞米松1 μmol/L)培養14 d后棄去培養液,PBS沖洗,多聚甲醛固定,用油紅O染色液染色。

1.2.4 CCK-8法測定hPDLSCs增殖情況 將第4～5代hPDLSCs以2×104個/孔的密度接種于放置有3組試件的24孔板,每組設3個復孔(n=3),隔天換液,培養1、3、5、7 d后,吸棄培養基,每孔加入600 μL培養基和60 μL CCK-8試劑,在37 ℃培養箱里孵育2 h,每孔吸取100 μL置于96孔板中,用酶標儀測定450 nm波長下的OD值。

1.2.5 ALP活性檢測 將hPDLSCs以2×104個/孔的密度接種于孔底置有各組試件(n=3)的24孔板中,待細胞貼壁后,棄去原培養液,更換為成骨誘導培養基,每2 d換液1次,誘導7、14 d。吸棄培養基,PBS清洗3次,每孔加入100 μL RIPA裂解液,裂解30 min,BCA法測定蛋白濃度。按照ALP測定試劑盒要求,在520 nm波長處用酶標儀測定各孔吸光度值,計算ALP活性。

1.2.6 茜素紅染色 將hPDLSCs接種于置有各組試件(n=3)的24孔板中,細胞密度為2×104個/孔,待細胞貼壁后,棄去原培養液,更換為成骨誘導液,培養21 d后進行茜素紅染色,用體視顯微鏡拍照記錄。

1.2.7 實時熒光定量PCR(qPCR) 細胞接種于各組試件(n=3)行成骨誘導培養14 d后,用Trizol試劑裂解細胞,提取總RNA。RNA濃度通過核酸定量儀測定,按照cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行反轉錄、實時熒光定量PCR(qPCR)反應,引物序列如表1所示。qPCR反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,運行40個循環,以GAPDH作為內參,根據2-ΔΔCt法對成骨標志基因ALP、RUNX2、OCN進行基因相對表達倍數轉化。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 鈦試件表面觀察及成分分析

大體觀覆蓋鉭涂層的試件如圖1所示,呈黑灰色,表面較為粗糙。掃描電鏡下觀察,Ta組試件與SLA組試件的表面形貌如圖2所示。SLA組表面可見酸蝕、噴砂后形成的大小不一的坑槽樣結構;Ta組表面可見扁平狀的鉭顆粒相互連接,其間夾雜部分類球形微粒,形成尺寸不一的不規則氣孔,組成具有微納米結構的涂層表面。Ta組試件截面圖像顯示鉭涂層與SLA鈦表面結合緊密,且涂層在垂直方向上可見層層堆積的鉭顆粒形成的孔隙(圖3)。EDS分析圖譜表明涂層的主要元素成分是鉭(圖4),證明了在鈦試件上成功制備了鉭涂層。

圖1 Ta涂層試件外觀

A:SLA組表面低倍鏡( ×200);B:Ta組表面低倍鏡( ×200);C:SLA組表面高倍鏡( ×1 500);D:Ta組表面高倍鏡( ×1 500);SLA組表面可見酸蝕、噴砂后形成的大小不一的坑槽樣結構;Ta組表面可見扁平狀的鉭顆粒相互連接,其間夾雜部分類球形微粒,形成尺寸不一的不規則氣孔,組成具有微納米結構的涂層表面

圖3 Ta組試件截面SEM圖像( ×2 000)

圖4 Ta組試件表面元素EDS分析圖譜

2.2 hPDLSCs的培養和鑒定結果

原代hPDLSCs的分離、培養采用組織塊法,在培養5～7 d時可觀察到細胞從組織塊周圍貼壁爬出,倒置顯微鏡下觀察細胞呈星形或梭形,如圖5A所示。當細胞生長至80%融合時可進行消化、傳代,傳代后的細胞生長狀態良好,顯微鏡下觀察呈漩渦狀排列,如圖5B所示。

A:原代hPDLSCs( ×40);B:第3代hPDLSCs( ×40);標尺大小:500 μm

流式細胞儀檢測結果見圖6,細胞高表達間充質干細胞標志物CD44、CD90、CD105、CD73,對造血干細胞標志物CD34、CD45幾乎不表達,證實培養的細胞為間充質來源。

圖6 流式細胞儀檢測hPDLSCs表面相關抗原

成骨誘導21 d,茜素紅染色后可觀察到大量礦化結節形成(圖7A),表明細胞具有成骨分化的能力。成脂誘導培養14 d,油紅O染色后可觀察到紅色油滴(圖7B),證實其具有成脂分化的能力。

A:hPDLSCs成骨分化( ×100),標尺:200 μm;B:hPDLSCs成脂分化( ×400),標尺:50 μm

2.3 鉭涂層對hPDLSCs增殖能力的影響

通過CCK-8法檢測各組試件表面hPDLSCs增殖情況,結果見表2、圖8。在1 d時,三組細胞的OD值差異無統計學意義,在培養3、5、7 d后,Ta組OD值明顯高于SLA組及P組(P<0.05);在培養5、7 d后,SLA組OD值明顯高于P組(P<0.05)。

圖8 CCK-8檢測hPDLSCs增殖情況

表2 CCK-8檢測hPDLSCs增殖情況

2.4 ALP活性檢測結果

ALP活性檢測結果如表3所示,細胞的ALP活性呈現升高的趨勢。在第7天時,三組間的差距無統計學意義;第14天時,Ta組ALP活性明顯高于P組和SLA組,具有顯著差異(P<0.01),而P組和SLA組之間差異無統計學意義。

表3 堿性磷酸酶活性檢測

2.5 茜素紅染色結果

細胞與3組試件共培養21 d后的茜素紅染色結果見圖9,三組材料表面都有紅色鈣化結節形成,SLA組和Ta組的紅染區域明顯多于P組,Ta組礦化結節相對于SLA組更為密集。

A:P組試件;B:SLA組試件;C:Ta組試件;標尺:1 mm

2.6 成骨相關基因表達結果

成骨誘導培養14 d時,qPCR檢測結果如表3所示。Ta組和SLA組的ALP基因表達差異無統計學意義,但Ta組高于SLA組,與P組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。Ta組RUNX2、OCN基因表達水平高于SLA組和P組(表4),且差異具有統計學意義(P<0.01)。SLA組ALP、RUNX2、OCN的基因表達顯著高于P組(P<0.05)。

表4 ALP、RUNX2、OCN mRNA相對表達量

3 討 論

種植體表面物理和化學性質對早期形成穩定的骨結合具有很大的影響[10],對種植體表面進行改性能夠提高其生物活性[11-12]。單純的SLA處理僅能改變種植體的表面形貌,且以往的回顧性研究發現經SLA處理的鈦合金表面金屬微粒脫出,可導致細胞毒性且加速種植體的腐蝕[13]。涂層能夠改變種植體的表面生物學性能,同時能起到對鈦基底的保護作用。在SLA鈦表面通過等離子噴涂制備出具有微納米級表面特征的鉭涂層,既改變了表面形貌又改變了化學元素組成。鉭具有出色的機械性能、耐腐蝕性和良好的骨誘導性[14],能夠提高鈦板的生物活性和力學性能[15]。SEM、EDS分析結果表明,具有微納米結構的鉭涂層覆蓋在SLA鈦表面,且結合緊密。

目前國內外對于骨缺損修復的研究已趨向于將生物材料和細胞聯合的骨組織再生工程,干細胞在組織再生方面顯示出良好的前景,并被考慮應用于骨缺損的修復。以往的骨再生研究中多應用骨髓間充質干細胞,但其分化能力會隨細胞傳代迅速減弱,而牙周膜干細胞的增殖、分化能力在傳代過程中較為穩定,且取材相對容易。從牙周膜中分離的hPDLSCs可作為頜骨再生的成骨前體細胞的來源[16]。實驗通過CCK-8法檢測三組樣品對PDLSCs的增殖的影響,發現hPDLSCs與三組試件共培養1、3、5、7 d后,Ta組的hPDLSCs的增殖速度較SLA組和P組明顯提高,表明鉭涂層表面對于細胞的生長增殖具有促進作用。前期已有研究表明鉭涂層表面有更高的蛋白質吸附能力,這決定了細胞早期能夠在材料表面獲得更好的黏附和鋪展[17],從而為細胞增殖和分化提供有利條件[18]。此外,結構復雜的種植體表面具有更大的表面積,延長了形成細胞融合的時間,允許細胞在達到接觸抑制之前進行更大面積的增殖[19]。從仿生學角度來講,鉭涂層改性的微/納米結構的表面與天然的骨結構更為相近,合適大小的微窩結構能夠使接觸的細胞獲得與成骨表型接近的長徑比[20-21]。且鉭涂層表面的Ta2O5具有生物活性,與微/納米結構具有協同促進細胞黏附增殖的作用[22]。細胞的快速增殖使種植體表面與周圍組織的有效接觸面積增加,提高了組織-種植體表面相互作用強度,有利于形成良好的骨結合[23]。

成骨誘導性對提高種植成功率具有重要意義,是影響種植體早期穩定的重要因素。堿性磷酸酶在骨礦化早期發揮功能,其水平升高與骨形成率呈正相關。本研究中,ALP活性檢測顯示在第14天時,各組的ALP活性最高,Ta組明顯高于SLA組和P組。這表示鉭涂層表面能夠促進hPDLSCs的早期成骨分化。過去的研究也表明,鈦鉭梯度材料相比純鈦材料,能提高成骨細胞的ALP活性[24]。在細胞與材料培養21 d后進行茜素紅染色,鉭涂層上的分化細胞群比粗糙或光滑鈦表面上的細胞產生更多的鈣結節,這表明鉭涂層表面的骨誘導性增強,這與先前的研究結論一致[25-26]。而qPCR對成骨相關基因的檢測結果進一步證實了鉭涂層組的促成骨作用。通過對成骨相關基因ALP、RUNX2、OCN表達的檢測來比較不同試件對細胞成骨活性的影響,結果顯示Ta組對成骨的促進作用最佳。ALP是成骨礦化機制中最重要的功能基因之一,在礦化周期的早期發生,能夠啟動骨細胞的鈣離子沉積[27];OCN是在細胞分化后期分泌的非膠原蛋白,在合成和重建骨組織過程中有著重要作用,能反映礦物質的沉積情況[28];RUNX2是調節干細胞向成骨細胞分化和成熟的主要轉錄因子,誘導骨基質蛋白基因的表達,在缺乏RUNX2的情況下不會發生成骨[29]。近年來,已發現鉭的成骨誘導性與許多經典的成骨信號通路有關[30],這從發生機制上解釋了鉭能夠促進hPDLSCs成骨的原因。

綜上所述,SLA鈦表面制備的鉭涂層能夠促進hPDLSCs的增殖和成骨分化,具有良好的生物相容性,等離子噴涂技術能夠在傳統鈦種植體表面制備具有微納米級結構的鉭涂層,為開發新型種植體提供了思路。本實驗研究提示,與傳統的鈦合金種植體材料相比,鉭涂層能更好地促進牙周干細胞的增殖和成骨分化,這為后期種植體表面設計的優化提供了生物學指導。但是種植體的長期效果在體內會受到更多因素的影響,因此鉭涂層鈦種植體的性能還需要進一步的體內實驗證實。