基于網絡藥理學和分子對接技術研究四物湯配伍黃芪提高免疫力的作用機制

楊艷,劉丹,鄧春海,王雨辰,韓峰

(承德市市場監督管理綜合執法局,河北 承德 067000)

四物湯是常用于補血的傳統方劑,由當歸、川芎、白芍、熟地黃四味中藥組成。首載于唐代骨傷科大家藺道人的《仙授理傷續斷秘方》,具有補血活血,調經化瘀之功;主治沖任虧虛,月經不調,崩中漏下,血瘕塊硬,胎動不安,腹痛血下等中醫學領域的病癥。傳統中醫認為“氣為血之帥,血為氣之母”,氣與血在中醫學理論中有著密不可分的關聯。因此,黃芪作為補氣要藥,非常適合與四物湯配伍聯合使用。“衛氣”“營血”等中醫概念與現代醫學有的“營養”“免疫”等概念有一定重合。現代藥理學[1-3]表明,當歸、熟地黃、黃芪中所含的多糖成分可有效提高機體免疫力。因此,使用四物湯配伍黃芪(SWT-H)提高機體免疫力具有一定的理論基礎和潛在可行性。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術,尋找SWT-H中與免疫功能相關的有效成分,挖掘其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 方法

1.1.1 SWT-H的有效成分篩選 使用TCMSP數據庫,通過對SWT-H中五味中藥所含的有效成分進行搜索,按照OB>30%、DL值>0.18的標準進行篩選。排除重復成分、以及數據庫中明顯出現錯誤的成分。同時,采用文獻檢索的方法,在CNKI、PubMed等文獻數據庫上檢索五味中藥的相關報道,以補充因數據庫本身不足而帶來的有效成分缺失。

1.1.2 SWT-H的有效成分作用靶點以及提高人體免疫力相關靶點預測 使用PharmMapper數據庫,對所得成分所作用的靶點進行預測分析[4]。將得到的靶點蛋白帶入Uniprot數據庫進行名稱標準化,得到成分所作用靶點的基因名稱。使用GeneCards數據庫,對腎臟缺血再灌注損傷后纖維化對應的提高人體免疫力靶點進行搜索,確定搜索關鍵詞為Renal ischemia-reperfusion injury和Renal fibrosis。分別取各自結果的前500種靶點。并對檢索結果進行整理、合并、去除重復項。上述成分所作用的靶點與提高人體免疫力對應的靶點帶入Jvenn平臺進行韋恩分析,并繪出二者重復情況的圖片。二者重合部分即為SWT-H提高人體免疫力的潛在核心靶點。

1.1.3 PPI網絡與中藥-成分-靶點-功能網絡構建 將上述潛在核心靶點帶入String數據庫,進行蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)分析,并構建出PPI網絡作用圖。同時,根據上述分析所得中藥、有效成分、作用靶點、功能靶點的關系,使用Cytoscape 軟件,構建出中藥-成分-靶點-功能網絡圖。

1.1.4 基因富集分析 將核心靶點帶入Metascape在線平臺進行GO分析:包括通路和生物學過程富集分析、細胞功能類型分析,并對富集分析的結果進行可視化處理。

1.2 分子對接

采用分子對接技術,對上述網絡藥理學分析進行進一步驗證。利用PDB數據庫(http:// www.rcsb.org/)下載 PPI 網絡的核心蛋白質結構,利用PubChem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov /)數據庫下載核心有效成分的sdf文件,將其利用 OpenBabel 軟件轉化為 mol2 格式,最后將得到的蛋白結構(受體)及有效成分(配體)運用 autodock 軟件進行分子對接,最后使用Discovery Studio和 Pymol 軟件將分子對接的結果可視化。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1 SWT-H有效成分篩選結果 通過TCMSP平臺搜索、文獻查閱的方法,最終得到SWT-H所含有效成分93種,其中,當歸32種、熟地黃17種、川芎8種、白芍12種、黃芪30種,重復成分6種。

2.1.2 SWT-H有效成分作用靶點以及提高人體免疫力相關靶點預測結果 使用PharmMapper對SWT-H的有效成分進行靶點預測,每種成分所作用的靶點取前30種,除去重復項,得到211種SWT-H有效成分所作用的靶點。GeneCards數據庫搜索與人體提高免疫力相關的靶點,搜索關鍵詞為Develop immunity from disease,共取500種相關靶點。Jvenn平臺進行韋恩分析并作圖,得到重復靶點29種。該29種靶點即為SWT-H提高人體免疫力的潛在核心靶點。見表1及圖1。

表1 SWT-H提高人體免疫力的核心靶點匯總

2.1.3 PPI網絡與中藥-成分-靶點-功能網絡構建結果 將29種核心靶點代入String平臺進行PPI分析,并做出PPI網絡圖。得到如下結果:節點數為29、邊數為149、平均節點度為10.3。其中節點表示蛋白靶點、節點度表示每個幾點連接的邊數。在29種核心靶點中,節點度大于平均節點度的共有13種,提示該13種靶點在SWT-H發揮增強免疫力的過程中扮演更加重要的角色。運用Cytoscape軟件構建出SWT-H提高人體免疫力的中藥-成分-靶點-功能網絡圖。根據結果顯示,洋川芎內酯 A(Senkyunolide A)、洋川芎內酯 I(Senkyunolide I)、芍藥苷(Paeoniflorin)、3,3′Z-6.7′,7.6′-雙藁苯內酯(3,3′Z-6.7′,7.6′-diligustilide)等成分,可能是SWT-H提高人體免疫力的核心成分。見圖2及圖3。

2.1.4 基因富集分析結果 (1)通路和生物學過程富集分析結果:通過Metascape平臺對29種核心靶點進行GO通路和生物學過程分析[5]。根據相關性降序排列,選取前20種條目。做出柱形圖和網絡圖對結果進行數據可視化。其中,癌癥相關通路(hsa05200:Pathways in cancer)、止血過程(R-HSA-109582:Hemostasis)、傷口愈合(GO∶0042060:wound healing)、炎癥、COX-2和EGFR的關系(Relationship between inflammation)等條目與增強人體免疫力高度相關。見圖4。(2)細胞功能富集分析結果 通過Metascape平臺對29種核心靶點進行細胞功能富集分析,得到如下條目:肝臟HEPG2細胞(PGB∶00002)、肝細胞(PGB∶0007)、脾臟細胞(PGB∶00011)、THY+細胞(PGB∶00047)、支氣管上皮細胞(PGB∶00081)、胎盤細胞(PGB∶00045)、人臍靜脈內皮HUVEC細胞(PGB∶00031)。其中,脾臟細胞(PGB∶00011)、THY+細胞(PGB∶00047)等詞條與提高人體免疫力高度相關。見圖5。

2.2 分子對接結果

根據分子對接結果,發現SWT-H所含有效成分洋川芎內酯A可與MAPK1的周圍氨基酸殘基PHE(A∶33)、THP(B∶40)、TRP(B∶41)、TRP(A∶41)、HIS(B∶90)相互作用。SWT-H所含有效成分黃芪甲苷(Astragaloside IV)可與甲狀腺素視黃質運載蛋白(transthyretin,TTR)的周圍氨基酸殘基ALA(A∶52)、VAL(A∶39)、LYS(A∶54)、CYS(A∶166)、LEU(A∶156)相互作用,提示該兩種有效成分與該兩種關鍵靶點有著較強的結合能力。見圖6及圖7。

3 討論

近年來研究[6]表明,中藥在提高人體免疫力方面有較好的優勢,但機制尚未完全被闡明。誘導型一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase inducible,NOS2)是一種分布在人體全身的信使小分子,具有一定免疫調節功能。NO在一定條件下生成活性氮(reactive nitrogen species, RNS),RNS會和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)共同提供氧化還原化學反應釜,構筑成人體對抗外來病原體感染的首道防線[7]。SWT-H中所含的有效成分,如焦地黃內酯(Jioglutolide)可有效地靶向作用于NOS2,推測其可通過影響多個器官內NOS2的表達,發揮調控RNS合成水平的作用,從而調節機體免疫功能。

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種來源廣泛的內分泌免疫物質,可來源于機體免疫細胞和非免疫細胞,能夠限制體內巨噬細胞的活動。通常情況下,MIF在巨噬細胞內保持高表達,從而使巨噬細胞保持靜息狀態。在一定刺激下,MIF可誘導巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α),并使γ干擾素(IFN-γ)誘導巨噬細胞產生NO,從而增強巨噬細胞對感染的反應能力。除對巨噬細胞的控制作用外,MIF還表現出促進T細胞的增殖的作用[8]。網絡藥理學分析表明,SWT-H所含多種有效成分,地黃苷A(Rehmannioside A)、6-甲氧基當歸素(Sphondin)、焦地黃呋喃(Jiofuran)等,可靶向作用于MIF,發揮調節機體內巨噬細胞、T細胞等免疫細胞的增殖、遷移等功能,從而調控機體的免疫功能。除MIF外,許多靶點通路參與影響T細胞的增殖。如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路。MAPK蛋白家族包括許多成員,其中p38MAPK,又稱MAPK14,可促進T細胞增殖;特異性阻斷MAPK14信號通路還可減少脾臟指數[9-10]。網絡藥理學分析表明,SWT-H含多種有效成分,如異黃芪皂苷 IV(Isoastragaloside IV)、洋川芎內酯 A(Senkyunolide A),可作用于MAPK1;地黃苷C(Rehmaionoside C)、地黃素D(Rehmaglutin D)可作用于MAPK14,激活MAPK通路,發揮增強免疫的功能。分子對接結果表明,洋川芎內酯 A與MAPK1有較好的結合能力,黃芪甲苷與TTR有較強作用力,同樣也驗證了網絡藥理學預測結果。除上述直接作用外,部分體內激素和營養物質對人體免疫力也起到關鍵作用,如甲狀腺素、維生素A等。甲狀腺激素參與免疫調節,在固有免疫和適應性免疫中發揮著重要作用[11];維生素A可影響消化道微生物結構、修復屏障功能、改善黏膜免疫反應,從而減少腸道感染[12]。這兩種物質的水平均受到體內一種特殊轉運蛋白,即甲狀腺素視黃質運載蛋白(transthyretin,TTR)的調控。分子對接結果表明,SWT-H所含有效成分黃芪甲苷與TTR有較好的結合能力,推測該有效成分可靶向激活TTR,提高人體甲狀腺激素和維生素A向重要器官的轉運能力,從而增強人體免疫力。

綜上,SWT-H可通過如下幾種潛在機制,提高人體免疫力:(1)Jioglutolide調節NOS2/NOS3的表達水平,促進RNS合成,增強人體組織修復、對抗感染能力。(2)異黃Isoastragaloside IV、Senkyunolide A調控MIF在巨噬細胞內的表達,改善巨噬細胞功能,增強人體對抗病原能力。(3)Rehmaionoside C、Rehmaglutin D調控MAPK、MIF等相關靶點和通路,促進T細胞增殖。(4)黃芪甲苷靶向激活TTR,提高體循環種甲狀腺激素和維生素A的轉運能力,從而增強人體免疫力。