超高液相色譜-串聯質譜法測定貝類組織中環境雄激素睪酮的前處理方法優化

付梅， 申春琴， 汪政希， 劉梅， 姚維志， 原居林， 彭希文， 呂紅健

1. 西南大學 水產學院/淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室/農業農村部長江上游水生生物多樣性保護研究中心，重慶 400715；2. 浙江省淡水水產研究所/農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室/浙江省魚類健康與營養重點實驗室，浙江 湖州 313001

環境雄激素作為一類典型的內分泌干擾物, 不僅會干擾生物體的內分泌系統導致其生長發育受阻, 同時還會影響微生物群落的結構與功能[1-2], 并對人體健康和生態安全造成威脅． 環境中的雄激素主要來源于動物的分泌物和激素藥物的使用[1,3-4]． 研究發現, 環境雄激素主要通過城市污水處理廠、 畜禽養殖場、 造紙廠及水產養殖場等廢水排放進入水環境, 可蓄積在水生生物體內, 并沿食物鏈進行傳遞, 進而對水域生態系統和人體健康造成危害[1,3-4]． 貝類作為水生食物網尤其是底棲食物網的重要組成部分之一, 對水域生態系統的物質循環和能量流動具有重要的作用[5-6]; 同時, 貝類因口味鮮美、 營養價值高, 深受消費者的喜愛． 睪酮(Testosterone), 又稱睪丸素、 睪丸酮, 是生物體內含量最高、 最重要的雄激素, 也是一種主要的環境雄激素[1]． 開發一種測定貝類組織中睪酮質量濃度的前處理方法, 有助于貝類組織中類固醇激素的定量分析, 可為研究類固醇激素污染物在底棲食物網中的遷移轉化與貝類水產品安全監管提供方法基礎與技術支撐．

前處理方法中樣品的提取與凈化對水產品中類固醇激素測定的回收率、 穩定性等具有較大的影響． 陳秋華等[22]在篩查水產品16種激素殘留的研究中發現, 提取劑和吸附劑的種類和使用量均會影響目標化合物的回收率． 通常用于提取動物組織中激素物質的溶劑有乙酸乙酯、 甲醇、 正己烷、 叔丁基甲醚、 二氯甲烷、 乙腈、 乙醚等及其混合溶液[23-26], 但由于目標激素和基質差異, 樣品前處理提取劑的選擇并無統一定論, 因此針對貝類中特定激素測定需進行提取劑的優化篩選． 樣品經過提取和富集后, 常采用液相萃取除脂法[27-29]、 固相萃取柱凈化法[24,30-31]、 凈化劑凈化法[17,22, 32]、 超低溫冷凍離心除脂法[19,33-34]等去除樣品基質中的脂肪、 蛋白質等雜質, 從而降低干擾, 提高方法的檢出限, 并延長儀器的使用壽命[23]． 黃鸞玉等[19]認為, 除脂是水產品前處理必不可少的步驟, 且除脂方法以及固相萃取柱的選擇都會影響凈化效果． 李佩佩等[35]在測定水產品中甲基睪酮的殘留時發現, 石油醚作為除脂溶劑, 易殘留, 會對目標物造成嚴重干擾, 因此, 除脂凈化方法直接影響貝類中雄激素的回收率． 冷凍離心除脂法因操作簡便、 凈化效果好、 待測激素損失較低[18,36], 常單獨或與其他方法結合使用, 被廣泛應用于各種基質中激素物質的凈化． 本研究擬在超低溫冷凍離心的基礎上, 結合凈化劑[37-38]和固相萃取柱[19], 探尋適用于貝類的高效率凈化方法．

水產品中類固醇激素的檢測研究對象多為魚類和甲殼類, 貝類中的類固醇激素測定的研究鮮見報道[17, 39], 因此, 本研究擬以典型雄激素睪酮作為目標化合物, 利用超高液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS), 對貝類-河蜆(Corbiculafluminea)樣品前處理方法中的提取和凈化等條件進行優化, 以期得到較為理想的貝類雄激素測定前處理方法．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

睪酮, 北京索萊寶科技有限公司; 睪酮-d3, SUPELCO公司, 純度均大于98.0%． 甲醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙腈、 正己烷、 二氯甲烷, Honeywell公司; 甲酸, CNW公司; 叔丁基甲醚, Alfa Aesar公司, 以上有機試劑均為色譜純試劑． 中性氧化鋁(FCP100-200目), 上海瀘試實驗室器材股份有限公司; 無水硫酸鎂(99.95%), 無水硫酸鈉(99.95%), 上海麥克林生化科技有限公司, 均為分析純． N-丙基乙二胺(PSA), 杭州微米派科技有限公司; 高純氮氣, 重慶啟迪氣體有限公司; Poly-sery HLB(Hydrophilic and Lipophilic Balance)固相萃取柱, CNW公司．

1.2 標準曲線的配制

用乙腈將4.00 mg/L的睪酮標準儲備溶液逐級稀釋, 配制成0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的標準溶液, 混勻后測定, 以質量濃度為橫坐標, 以色譜圖峰面積為縱坐標繪制標準曲線．

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的制備

實驗所用河蜆購自重慶市開州區某養殖場, 剖取軟體組織于離心管中, 組織搗碎機搗碎并充分勻漿, -20 ℃保存備用．

1.3.2 睪酮的提取

一個黑社會組織，之所以能夠作惡近20年，得益于背后的“保護傘”——無為縣法院刑事審判庭原副庭長吳業平。據周幫海供述，吳業平有“能量”。七年前，周幫海的馬仔吳克任犯下兩起尋釁滋事、兩起故意傷害案件，他向吳業平送上2萬元并請求輕判。在“吳庭長”的操縱下，身負四起情節嚴重案件的吳克任，僅被判處緩刑二年。連吳業平自己都說：“像這樣的案子判緩刑，在法院還從來沒有過。”

目標提取物睪酮為弱極性化合物, 本研究分別選用乙酸乙酯、 乙腈、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)4種提取劑提取睪酮, 具體步驟如下:

準確稱取(1.00±0.02) g勻漿試樣于研缽中(3重樣), 加入5 g預烘(110 ℃, 12 h)后的無水硫酸鈉, 研磨至生物樣品不粘在研缽上, 靜置30 min后, 轉移至50 mL離心管中, 并用5 mL提取劑潤洗研缽和研磨杵, 全部轉移至離心管中; 加入0.5 mL質量濃度為1 μg/mL的睪酮-d3, 混勻; 向離心管中再次加入提取劑5 mL; 渦旋振蕩提取5 min后, 超聲10 min; 再次渦旋振蕩5 min后, 靜置提取1 h; 于4 ℃ 5 000 r/min離心10 min后將上清液轉移至新的50 mL離心管中; 殘渣用5 mL提取劑重復提取2次, 合并上清液(共20 mL), 待凈化．

針對不同提取劑進行回收率比較分析時, 統一采用超低溫冷凍離心法凈化樣品．

1.3.3 凈化

超低溫冷凍離心: 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)復溶后, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

超低溫冷凍離心-凈化劑: 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取10 mL上清液于已加入凈化劑(0.5 g無水硫酸鎂, 0.5 g中性氧化鋁和0.2 g PSA)的離心管中, 渦旋混勻5 min, 以10 000 r/min離心5 min后準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)復溶后, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱: 預先用3 mL甲醇和3 mL水先后緩慢通過HLB固相萃取柱使其充分活化; 將上清液于-80 ℃冷凍1 h; 解凍后, 于4 ℃ 10 000 r/min離心8 min; 準確移取5 mL上清液于玻璃試管中, 氮氣吹干后加入3 mL甲醇溶解殘渣, 并將其轉至15 mL離心管中; 再用7 mL純水潤洗玻璃試管, 合并至離心管中, 混勻; 取甲醇溶液層以小于2 mL/min的流量通過預先活化的HLB固相萃取柱上樣, 棄去濾液; 再用6 mL的20%甲醇溶液通過HLB固相萃取柱進行淋洗, 棄去流出液, 抽吸HLB固相萃取柱至近干; 用4 mL的90%甲醇溶液對HLB固相萃取柱進行洗脫, 收集洗脫液; 將洗脫液在50 ℃下氮氣吹干后, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)充分復溶, 定容至1 mL; 過0.22 μm有機濾膜, UPLC-MS/MS測定．

1.4 UPLC-MS/MS條件

采用Waters UPLC-Q-TOF-MS ACQUITY UPLC系統在靈敏模式下用正電噴霧(ESI+)離子源對睪酮定量． 色譜柱為ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 睪酮進樣體積為1 μL, 恒定流速為0.4 mL/min; 流動相由0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)組成; 去溶劑化溫度和離子源溫度分別為400 ℃和120 ℃, 錐形和去溶劑化的流速分別為50 L/h和800 L/h; 毛細管電壓和錐形電壓分別為3 000 V和40 V, MS碰撞能量范圍為20～40 eV(圖1)．

圖1 乙酸乙酯提取睪酮的多反應監測色譜圖

1.5 數據處理

對實驗所得數據用Microsoft Excel 2019進行處理．

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

本研究考察了乙酸乙酯、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈4種提取劑對貝類-河蜆組織中睪酮的提取效果． 由表1可知, 乙酸乙酯作為提取劑回收率最高, 達101.6%, 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈對睪酮的提取回收率相當, 在84.8%～89.4%之間． 4種提取劑中, 正己烷-二氯甲烷(1∶1)提取效率最低, 可能是正己烷提取油脂雜質較多, 不利于凈化[40]． 使用乙腈作為提取劑時相對標準偏差為12.6%, 遠大于其他3種提取劑, 表明乙腈作為提取劑穩定性不足, 可能是乙腈能致蛋白質變性, 易使樣品結塊, 從而導致回收率不穩定[41]． 綜上所述, 4種提取劑中, 乙酸乙酯作為提取劑回收率高且穩定, 是河蜆組織中提取睪酮的最優選擇．

表1 提取劑對睪酮回收率的影響

2.2 凈化方法的選擇

超低溫冷凍離心、 超低溫冷凍離心-凈化劑、 超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱3種凈化方法的凈化效果見表2． 結果表明, 提取方法相同的情況下, 超低溫冷凍離心法的回收率為89.4%, 高于超低溫冷凍離心-凈化劑法和超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱法． 超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱法回收率最低, 為77.4%, 原因可能是采用固相萃取柱進行萃取損失了部分目標化合物． 結果表明, 通過超低溫冷凍離心法凈化樣品, 凈化效果好、 回收率高、 操作簡便, 可作為河蜆組織中睪酮提取后的凈化方法．

表2 凈化方法對睪酮回收率的影響

2.3 線性范圍、 檢出限和定量限

在選定的色譜/質譜條件下測定質量濃度分別為0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的睪酮標準溶液系列, 結果表明, 睪酮質量濃度在0.05～1.00 μg/mL內與色譜峰面積呈線性正相關, 其回歸方程為y=390 214x-12 033,R2=0.998 9．

根據信噪比S/N≥3作為檢出限,S/N≥10作為定量限, 計算得出河蜆組織中睪酮的檢出限和定量限分別為6.25 ng/g和20 ng/g．

2.4 回收率和精密度

針對空白基質樣品, 加標回收實驗分別添加睪酮標準物質為低水平(20 μg/kg)、 中水平(40 μg/kg)、 高水平(200 μg/kg), 進行3次平行實驗． 測定結果表明, 睪酮的平均回收率為66.4%～101.1%, 測定值的相對標準偏差在2.3%～11.6%之間(表3)． 隨著加標量的增加回收率不斷升高, 在國家標準GB/T 27404-2008規定的精密度范圍內, 方法的準確度和精密度均符合實際分析檢測的要求．

表3 河蜆中睪酮的加標回收率及精密度(n=3)

2.5 水產品中雄激素提取方法比較分析

因提取所用生物樣品多為組織勻漿液, 含水率高, 基質水分殘留對提取凈化效果會產生較大影響[32]． 楊霄等[14]、 李凱華等[32]研究表明, 去除生物樣品中的水分有利于提高目標化合物的回收率． 提取前加入無水硫酸鈉[42-43]、 提取時加入無水硫酸鈉[32]或無水硫酸鎂[14]、 凈化前過無水硫酸鈉柱[8]等, 均可有效去除水分． 考慮操作簡便性及提取液體積的量化問題, 本研究中采用預烘后的無水硫酸鈉研磨勻漿后的樣品, 靜置至水分吸收完全后加入提取劑提取．

水產品中雄激素的提取常用的提取劑包括乙腈、 乙酸乙酯、 乙醚、 叔丁基甲醚、 甲醇、 正己烷、 乙腈-甲酸/乙酸混合液等[22, 24-25, 33]． 總體而言, 在超高液相色譜-串聯質譜法測定水產品內睪酮的前處理中, 乙酸乙酯作為提取劑的提取效果較好(表4)． 楊帆等[16]、 鄒紅梅等[17]、 李向軍等[24]研究均發現, 魚類和甲殼類中睪酮的提取使用乙酸乙酯效果最佳, 回收率高、 穩定性好, 優于乙腈、 正己烷、 甲醇等, 與本文關于貝類中睪酮的提取研究結果一致． 此外, 鄒紅梅等[17]、 李向軍等[24]研究還發現, 同時提取草魚中甲基睪酮等多種激素時, 乙酸乙酯對大部分目標化合物的提取效率高于甲醇和乙腈． 關于黃鱔、 明蝦等水產品中甲基睪酮、 群勃龍、 司坦唑醇等雄激素的提取研究亦表明, 乙酸乙酯作為提取劑的提取效率高, 且具有不易揮發、 毒性較小等優勢[16, 27, 34,44]． 而陳秋華等[22]研究發現1%乙酸-乙腈作為提取劑提取大黃魚、 南美白對蝦、 梭子蟹中的雄激素時, 提取效果優于乙腈、 乙酸乙酯、 丙酮． 李凱華等[32]采用1%乙酸-乙腈提取草魚中的雄激素, 能有效提取目標物． 綜上, 乙酸乙酯和1%乙酸-乙腈對水生生物體中雄激素提取效果均較好, 但雄激素的回收率還與提取對象、 雄激素種類、 提取方法和凈化方法等相關．

表4 水產品中睪酮檢測的前處理方法比較

提取過程中, 可采取渦旋、 振蕩、 超聲等方法輔助提升提取效果[25]． 本文在對睪酮進行提取時采用渦旋振蕩-超聲-渦旋振蕩的方式, 一方面超聲能增加提取劑的穿透力從而進入細胞內部[23], 提取率高、 操作簡便且樣品處理量多[8]; 另一方面, 振蕩可以加速被提取成分的擴散、 釋放[25], 使得提取更加充分． 提取過程中, 重復提取可提高樣品的回收率, 以重復1～2次為宜[17, 45-46]．

2.6 水產品中雄激素樣品凈化方法比較分析

樣品凈化方法中, 液相萃取除脂法, 常采用正己烷、 石油醚作為萃取劑． 然而黃鸞玉等[19]發現正己烷去脂的同時可一定程度溶解睪酮等類固醇激素, 故不可避免會造成目標化合物的損失, 且由于液相萃取過程中易發生乳化, 采用此法凈化樣品的回收率和精密度均不夠理想[18, 28]．

固相萃取柱凈化中常采用十八烷基鍵合硅膠吸附(C18)柱和HLB柱對水產品中的類固醇激素進行純化． 已有研究表明, HLB固相萃取柱基質可耐受不同的溶劑, 使用時回收率不受柱床干涸的影響, 且吸附劑表面積較C18柱大, 除雜效果更好[19]． 靳鳳龍[47]在研究動物源性食品中性激素的測定方法時發現, HLB固相萃取柱對性激素的回收率達89.7%～96.6%, 是C18柱的1.2倍． 李向軍等[24]發現, 采用HLB固相萃取柱凈化樣品時, 可獲得較高的回收率, 然而, 當處理對象為大黃魚等高油脂樣品時, 易發生乳化, 導致固相萃取柱堵塞． 本研究亦發現, 河蜆組織經提取后, 以超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱作為凈化方法時的樣品回收率低于其他方法, 表明凈化過程中目標化合物有損失．

凈化劑凈化樣品時, 常用的凈化劑包括PSA、 中性氧化鋁、 無水硫酸鎂、 NaCl等． PSA作為吸附劑能清除許多基質成分, 但范小龍等[37]研究發現僅加入PSA, 目標激素的回收率未明顯提高, 因此可加入其他凈化劑共同凈化樣品． 無水硫酸鎂在凈化過程中可吸取多余的水分[37], 中性氧化鋁具有良好的除脂能力[38], 二者與PSA共同凈化樣品可提高凈化效果． 任雪冬等[38]在測定土壤中激素藥物殘留時發現以PSA、 中性氧化鋁及無水硫酸鎂為凈化劑組合的樣品基質干擾最小, 回收率最高．

超低溫冷凍離心除脂法操作簡便、 凈化效果好、 待測激素損失較低[18], 已被廣泛應用于各種基質中類固醇激素的凈化． 孟霞等[34]研究發現, 黃鱔甲基睪酮的提取與凈化中采用低溫冷凍離心除脂, 樣品回收率達88.1%～105.5%． 低溫冷凍離心法常結合其他凈化法對提取樣品進行純化． 黃鸞玉等[19]將冷凍離心結合HLB固相萃取柱凈化羅非魚樣品, 甲基睪酮的回收率為73.6%～91.4%． 本研究中, 超低溫冷凍離心凈化后, 回收率最高, 高于超低溫冷凍離心-凈化劑和超低溫冷凍離心-HLB固相萃取柱, 表明超低溫冷凍離心凈化效果好, 超低溫冷凍后的凈化劑凈化和HLB固相萃取反而導致樣品存在一定程度的損失． 田良良等[33]在測定魚蝦中丙酸睪酮殘留量時亦發現, 僅采用超低溫冷凍離心法凈化樣品, 丙酸睪酮的回收率為71.2%～104.5%, 而超低溫冷凍離心與固相萃取柱相結合的方法并沒有使雜峰減少, 與本研究結果相一致． 使用超低溫冷凍離心法凈化樣品, 簡化了前處理步驟, 簡便易操作．

2.7 貝類中有機物的提取與凈化

水產品中類固醇激素的檢測研究對象多為魚類和甲殼類, 貝類中雄激素測定的研究鮮見報道[17,39]． 不同于魚、 蝦中激素的檢測主要針對肌肉中的激素, 貝類中激素檢測多針對所有軟體組織, 基質較復雜． 已有研究表明, 貝類組織中目標化合物提取的回收率變化范圍大． 貝類中關于多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)、 多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)等檢測相關文獻顯示, 貝類空白基質加標回收率差異均較大[43,48-52]． 曹方方等[42]研究亦表明, 花蛤中的有機氯農藥p, p’-二氯二苯二氯甲烷(p, p’-dichlorodiphenyl dichloroethane, p, p’-DDD)的回收率為62.3%～106.0%, 相對標準偏差為5.6%～21.0%, o, p’-二氯二苯三氯甲烷(o, p’-dichlorodiphenyl trichloroethane, o, p’-DDT)的回收率為73.8%～118.0%, 相對標準偏差為4.6%～16.0%．

本文采用乙酸乙酯作為提取劑, 超低溫冷凍離心作為凈化方法提取河蜆中的睪酮, 回收率為101.6%, 而空白基質加標回收率為66.4%～101.1%, 相對標準偏差為2.3%～11.6%, 變化范圍略大, 我們推測可能貝類軟體組織樣品基質較復雜, 自身造成的影響難以避免．

3 結論

本研究優化了河蜆組織中睪酮質量濃度測定的前處理方法: 選取乙酸乙酯作為提取劑, 渦旋振蕩超聲提取, 并經超低溫冷凍離心凈化后利用超高液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)進行定量分析． 該方法簡便、 快速, 且具有較高的準確度和精密度, 在20～200 μg/kg加標水平范圍內, 回收率為66.4%～101.1%, 相對標準偏差為2.3%～11.6%, 適用于河蜆組織中睪酮的提取測定, 也可為其他動物組織中的環境雄激素殘留分析提供參考．