hsa_circRNA_0002141靶向miR-217影響口腔癌進展的分子機制研究

宿偉鵬, 趙化榮, 李晨曦, 劉 攀, 張 洋, 龔忠誠

(新疆醫科大學第一附屬醫院1腫瘤中心, 2(附屬口腔醫院)頜面腫瘤外科, 3新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所, 烏魯木齊 830054)

口腔癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤,每年新確診病例超過30萬,其中口腔鱗狀細胞癌占90%以上,5年生存率僅為40%～60%[1]。若在早期進行干預,口腔癌患者的5年生存率可達80%以上,然而,大約50%的口腔癌患者在出現明顯癥狀如疼痛、出血或口腔和頜面部腫塊時已被診斷為晚期[2-3]。晚期口腔癌患者的治療費用不僅高昂,而且預后極差。由此可見,口腔癌的早期診斷與預后密切相關,因此,尋找早期診斷標志物和靶點是當前口腔癌研究的重點。

環狀RNA(circRNA)是內源性非編碼RNA,具有組織特異性和結構穩定性的特點。與傳統線性RNA相比,circRNA是通過反向剪接產生的共價閉合環,沒有5′-cap或3′-poly(A)尾結構[4]。目前,多項研究指出,circRNA在各種腫瘤組織與腫瘤細胞中異常表達,如宮頸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等,在調節腫瘤進展方面起著重要作用[5-8]。目前,關于hsa_circ_0002141的研究報道相對較少,有研究指出hsa_circ_0002141在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中的表達水平均顯著升高[9],這提示其異常高表達可能與該腫瘤的發生發展相關。circRNA通過與miRNA的競爭性結合發揮其在腫瘤中的作用功能,進而調節腫瘤中的基因表達。miR-217是一種廣泛表達的miRNA,已知其在多種腫瘤類型中充當腫瘤抑制基因[10],但其在口腔癌中作用尚未有相關研究報道。本研究以口腔癌細胞為研究對象,檢測細胞系中hsa_circ_0002141與miR-217的表達水平,通過抑制或過表達hsa_circ_0002141后觀察口腔癌細胞增殖、遷移和侵襲的變化,探討hsa_circ_0002141與miR-217之間可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人口腔鱗狀細胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu細胞和人正?？谇唤琴|形成HNOK細胞購于美國菌種保藏中心。胎牛血清(杭州四季青公司),青霉素-鏈霉素雙抗液與DMEM培養液(美國invitrogen公司),Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司),反轉錄試劑盒與熒光定量測定試劑盒(日本Takara公司),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翌圣生物公司),CCK-8增殖檢測試劑盒(北京索萊寶生物公司),EdU細胞增殖檢測試劑盒(廣州市銳博生物公司),DAPI染料和結晶紫染料(上海碧云天生物研究所),Transwell小室和Matrigel膠(美國Corning公司),si_NC、si_circ_0002141、pc_NC、pc_circ_0002141、miR-NC、miR-217 mimic、circRNA_0002141野生型載體及突變型載體構建均交由上海生工生物工程公司設計合成。

1.2 方法

根據上文的表述，目前國內高管薪酬各個部分的比例不當，缺乏長期的激勵，這容易引起高管人員的短期行為和利己行為，對于企業長期健康的發展十分不利。而恰當有效的長期激勵不僅可以使高管人員注重于企業和個人的雙贏發展，也可以使高管人員在風險管控方面更加謹慎、仔細。

1.2.1 細胞培養 將凍存的人口腔鱗狀細胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu細胞和人正常口腔角質形成HNOK細胞復蘇,添加含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養液,置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養, 直到細胞生長至約70%～80%融合,進行傳代培養。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應 在各組細胞中加入Trizol溶液,按照試劑盒說明書提取總RNA,微量核酸蛋白儀檢測RNA純度、濃度。調整提取的RNA樣品濃度,利用逆轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA后,使用Primer Premier5.0軟件設計引物,根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應體系,在實時熒光定量PCR系統上測定hsa_circ_0002141與miR-217的表達水平,以U6作為內參基因。擴增結束后,計算各組相應mRNA相對表達量,待測樣本mRNA相對表達量=2-△△Ct,實驗重復3次。引物序列如下: hsa_circRNA_0002141,上游引物5′-TATGCAGTTAAAAATATACA-3′,下游引物5′-GATCGGACACGGGTCTT-3′;miR-217,上游引物5′-TACTCAACTCACTACTGCATCAGGA-3′,下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′; U6,上游引物5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC-3′,下游引物5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-CCTTGC-3′。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測 通過CircInteractome在線工具預測hsa_circRNA_0002141與miR-217之間是否存在互補結合位點,根據預測結果,構建circRNA_0002141的野生型載體(circ_0002141 WT)和突變型載體(circ_0002141 MUT),按照脂質體法將構建的報告基因質粒分別與miR-NC或miR-217 mimic轉染至SAS細胞內,轉染48 h后,利用雙熒光素酶試劑盒檢測轉染后細胞中的熒光素酶活性。

小兒推拿學的生理特點主要有臟腑嬌嫩、形氣未充——五臟六腑稚陰稚陽、元氣不足—脾氣、肺氣、腎氣不足，心肝有余；生機勃勃，發育迅速；發病容易，轉化迅速；臟氣清靈，易趨康復?？深A防治療常見病，包括：小兒泄瀉、嘔吐、食積、厭食、便秘、腹痛、脫肛、感冒、咳嗽、哮喘、發熱、遺尿、夜啼、肌性斜頸、落枕、驚風等疾病，都有較好的效果。

1.2.4 實驗分組與轉染 將生長狀態良好的SAS細胞分為對照組、si_NC組(轉染si_NC)、si_circ_0002141組(轉染si_circ_0002141)、pc_NC組(轉染pc_NC)、pc_circ_0002141組(轉染pc_circ_0002141)、pc_circ_0002141+miR-NC組(共轉染pc_circ_0002141與miR-NC)、pc_circ_0002141+ miR-217 mimic組(共轉染pc_circ_0002141與miR-217 mimic),各組細胞均采用LipofectamineTM2000試劑盒進行轉染,嚴格根據說明書操作。轉染結束后,通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應測定轉染效果,收集轉染成功的細胞,用于后續實驗。

2.2 抑制或過表達hsa_circ_0002141對SAS細胞增殖能力的影響對各組SAS細胞增殖活性進行檢測發現,在培養24、48、72 h時,與對照組比較,si_circ_0002141組各時間點細胞增殖活性顯著下降(P<0.05),而pc_circ_0002141組各時間點細胞增殖活性顯著升高(P<0.05),見圖2A。經EdU染色后,與對照組比較,si_circ_0002141組EdU陽性率顯著降低(P<0.05),pc_circ_0002141組EdU陽性率顯著升高(P<0.05),見圖2B、2C。

1.2.7 Transwell實驗 在遷移實驗檢測中,將轉染后的SAS細胞采用無血清的DMEM培養基調整濃度,制成2×105個/mL的懸液,在Transwell下室加500 μL含血清的新鮮培養基,上室加入100 μL細胞懸液。將小室置于細胞培養箱內培養24 h,取去小室,棉簽擦掉未遷移細胞,經過多聚甲醛固定、結晶紫染色,封片,晾干,在光學顯微鏡下觀察細胞遷移數目并拍攝圖像,隨機選擇6個視野,計數該視野下遷移數目。侵襲實驗中,首先將稀釋的Matrigel膠鋪在Transwell 上室底部,并置于37℃培養箱形成基質層,后續步驟同遷移實驗。

1.2.6 EdU染色 將轉染后的SAS細胞調整密度至1×105個/mL,取100 μL接種至96孔板,在孔內加入10 μmol/L EdU試劑,室溫孵育2 h,PBS清洗,再加入Apollo488避光染色30 min,接著以Hoechst避光染色30 min,PBS清洗,封片,晾干,通過激光共聚焦顯微鏡觀察著色細胞并拍攝圖像,每張切片隨機選擇6個視野,計數該視野下EdU陽性細胞數與總細胞數,統計EdU陽性率,具體公式為:EdU陽性率(%)=EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.5 過表達miR-217對SAS細胞增殖的作用經檢測各組SAS細胞在培養24、48、72 h時的增殖活性發現,與對照組比較,pc_circ_0002141組細胞各時間點增殖活性顯著升高(P<0.05),與pc_circ_0002141組比較,pc_circ_0002141+miR-217 mimic組細胞各時間點增殖活性顯著降低(P<0.05),見圖5A。EdU染色結果顯示,pc_circ_0002141組EdU陽性率顯著高于對照組(P<0.05);而pc_circ_0002141+ miR-217 mimic組EdU陽性率顯著低于pc_circ_0002141組(P<0.05),見圖5B、5C。

(2)建議糖尿病患者炒菜時使用含不飽和脂肪酸的植物油,忌食動物脂肪,以減少飽和脂肪酸的攝入;一些膽固醇含量較高的食物,如動物內臟、魚子、蛋黃等,一定要少吃或者不吃。

2.3 抑制或過表達hsa_circ_0002141對SAS細胞遷移與侵襲的影響Transwell實驗檢測結果顯示,si_circ_0002141組SAS細胞遷移數目與侵襲數目均顯著低于對照組(P<0.05),pc_circ_0002141組細胞遷移數目與侵襲數目則顯著高于對照組(P<0.05),見圖3。

2 結果

2.6 過表達miR-217對SAS細胞遷移與侵襲的影響通過Transwell實驗檢測發現,與對照組比較,pc_circ_0002141組SAS細胞遷移數目與侵襲數目均顯著增加(P<0.05),與pc_circ_0002141組比較,pc_circ_0002141+miR-217 mimic組細胞遷移數目與侵襲數目均顯著減少(P<0.05),見圖6。

注: A, 各細胞內hsa_circ_0002141表達比較; B, 各細胞內miR-217表達比較。 與HNOK比較, *P<0.05。

1.2.5 CCK-8法 將轉染后的SAS細胞調整密度至1×105個/mL,取100 μL接種至96孔板,置于37℃、5%CO2培養箱內培養,分別在0、24、48、72 h時,通過CCK-8法檢測細胞增殖活性。將CCK-8試劑與培養基混合進行稀釋,取適量稀釋后的溶液加入細胞孔中,在培養箱繼續孵育2 h,利用酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度(OD)值,細胞增殖活性與OD值呈正比。

2.2 術前創面處理 給予暴露療法，支被架支撐，屏風遮擋保護患者隱私。協助醫師做好術前傷口換藥:雙氧水沖洗創面、0.02%聚維酮碘溶液消毒，每日1次?；前愤渎∪芤簼穹髣撁?，每日4次，頭孢菌素類抗生素和左氧氟沙星抗炎治療。

注: A, CCK-8法檢測細胞增殖活性; B, EdU染色觀察細胞增殖水平; C, EdU陽性細胞統計結果。 與對照組比較, *P<0.05。

注:與對照組比較, *P<0.05。

2.4 hsa_circ_0002141與miR-217相互作用的鑒定CircInteractome在線工具預測發現hsa_circ_0002141與miR-217之間存在互補靶向結合位點,見圖4A。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,與miR-NC組比較,circ_0002141 WT組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖4B。

注: A, CircInteractome軟件預測hsa_circ_0002141與miR-217靶向結合位點; B, 雙熒光素酶報告基因檢測熒光素酶活性。 與miR-NC組比較, *P<0.05。

根據工程場地上的孤石，經過研究將孤石的賦存形態分為：疊加型、完全出露型、部分埋入型、全部埋入型四大類。

注: A, CCK-8法檢測細胞增殖活性; B, EdU染色觀察細胞增殖水平; C, EdU陽性細胞統計結果。 與對照組比較, *P<0.05; 與pc_circ_0002141組比較, #P<0.05。

2.1 hsa_circ_0002141與miR-217在人口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達qRT-PCR檢測結果顯示,相較于人正?？谇唤琴|形成HNOK細胞,hsa_circ_0002141在人口腔鱗狀細胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu細胞中均顯著上調(P<0.05);miR-217在HSC3、SAS、SCC15、FaDu中的表達水平顯著低于HNOK中的表達水平(P<0.05),見圖1。

注:與對照組比較, *P<0.05; 與pc_circ_0002141組比較, #P<0.05。

3 討論

本研究經檢測發現,在人口腔鱗狀細胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu細胞中hsa_circ_0002141表達水平顯著上調而miR-217表達水平則顯著下調,過表達hsa_circ_0002141能夠促進SAS細胞增殖、遷移和侵襲,抑制其表達作用效果則相反,并證明了hsa_circ_0002141與miR-217存在靶向關系,提高miR-217表達能夠消除過表達hsa_circ_0002141對SAS細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用,這為口腔癌的特異性靶向治療方法提供實驗基礎與參考依據。

circRNA是穩定的RNA分子,通過與其他分子相互作用,以調節基因表達從而參與多種生物學過程或包括腫瘤在內的病理反應[11]。越來越多的研究表明,circRNA在口腔癌中發揮重要作用。例如,circUHRF1(circ_0002185)作為口腔鱗狀細胞癌細胞中新鑒定的一種circRNA,在該腫瘤組織及細胞中表達上調,其過度表達與口腔鱗狀細胞癌患者的不良預后密切相關,此外,在功能上circUHRF1能夠促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化以及體內腫瘤生長[12];circPVT1(circ_0001821)在口腔鱗狀細胞癌細胞和腫瘤樣本中表達上調,敲低其表達后該腫瘤細胞增殖受到抑制[13];circ-100290在20例口腔鱗狀細胞癌腫瘤樣本及腫瘤細胞系Tca8113、CAL27中均過表達,沉默circ_100290表達后促進了腫瘤細胞凋亡,并抑制細胞集落形成能力,減少了乳酸產生[14]。據報道[9],hsa_circ_0002141過表達能夠促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲,同時降低了細胞凋亡。本研究同樣發現,hsa_circ_0002141在口腔鱗狀細胞癌HSC3、SAS、SCC15、FaDu細胞中的表達水平均顯著上調,抑制其表達可降低細胞增殖,減少細胞遷移或侵襲數目,而過表達hsa_circ_0002141則促進了細胞增殖、遷移及侵襲。

miRNA是一種長度為18～22個核苷酸的短非編碼RNA,通過與靶mRNA堿基配對,在轉錄后作為基因沉默序列特異性負調控因子表達發揮作用,從而導致mRNA切割或翻譯抑制[15]?，F已知,miR-217作為腫瘤抑制因子在多種腫瘤進展中發揮作用,例如,miR-217可通過調節SIRT1和P53/KAI1信號通路抑制非小細胞肺癌的細胞增殖、遷移和侵襲[16];在胃癌中miR-217通過靶向PTPN14抑制腫瘤細胞上皮間質轉化[17];miR-217通過調節MAPK1表達水平抑制宮頸癌細胞系HeLa的遷移和侵襲[18];miR-217在卵巢癌細胞中通過靶向IGF1R來發揮腫瘤生長抑制作用[19]。然而,miR-217在口腔癌中的作用仍需進一步研究。

1963年11月22日，毛澤東同志對在社會主義教育運動中諸暨楓橋干部群眾創造的“在黨的領導下，發動和依靠群眾，堅持矛盾不上交，就地解決，實現捕人少、治安好”[1]101的經驗，親筆做出批示，“要各地仿效，經過試點，推廣去做”[1]101。從此，“楓橋經驗”成為全國政法綜治戰線的一面旗幟。50年來，紹興各級黨委、政府始終堅持“楓橋經驗”的基本精神不動搖，并緊跟時代發展步伐，不斷豐富和發展“楓橋經驗”。50年的實踐充分證明，“楓橋經驗”是踐行黨的群眾路線的鮮活“樣本”，是預防化解社會矛盾的一顆“常青樹”，是推動科學發展的一筆寶貴財富，使其在新時期愈發呈現出蓬勃的生機和旺盛的活力。

circRNA來源于RNA轉錄酶II的前體mRNA,不易被核酸外切酶RNase R降解,主要通過各種功能機制發揮轉錄和轉錄后調節的作用。circRNA含有大量的miRNA結合位點,具有miRNA海綿作用,進而間接調控miRNA下游靶基因的表達。同時circRNA也可以通過與RNA結合蛋白的結合來調控蛋白功能,例如通過與轉錄因子的結合來抑制基因的轉錄[20-21]。本研究通過生物信息學在線工具預測到miR-217與hsa_circ_0002141存在靶向互補結合位點,并在SAS細胞中通過雙熒光素酶報告基因測定實驗進行了驗證,證實了miR-217靶向負調控hsa_circ_0002141表達。此外,相較于單獨過表達hsa_circ_0002141,在SAS細胞中同時過表達miR-217和過表達hsa_circ_0002141后,細胞增殖、遷移及侵襲均受到抑制,提示hsa_circ_0002141/miR-217軸可能參與了口腔癌的腫瘤進展。

綜上所述,本研究證實hsa_circ_0002141調控口腔鱗狀細胞癌SAS細胞的增殖、遷移及侵襲,其作用機制可能與靶向吸附miR-217有關,這為口腔癌的診療和預后提供了潛在的候選靶標。然而,后續還需進行體內實驗研究,并將基礎實驗與臨床數據相結合,進一步探索circRNA在口腔癌治療中的可行性,從而為提高臨床患者療效開辟新的途徑。