ANXA6基因多態性與門冬氨酸氨基轉移酶水平的相關性研究

王運輝, 魏 嫻, 李 洋, 付真彥, 李曉梅, 馬依彤

(新疆醫科大學1第一臨床醫學院, 2第一附屬醫院心臟中心, 烏魯木齊 830054)

中國居民營養與健康狀況監測研究顯示,18歲及以上人群血脂異常率高達40.4%,血脂異常已成為誘發心腦血管疾病的主要危險因素[1-2]。研究表明,青年時期血脂異常與心腦血管疾病密切相關[3]。原發或繼發性肝臟損傷是導致血脂異常的主要因素[4]。血清中門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)升高是目前臨床診斷肝臟損傷的主要指標[5-6]。肝臟損傷會直接影響膽固醇的轉運和外排代謝活動。隨著遺傳連鎖分析、候選基因高通量測序和突變分析等分子遺傳技術在血脂異常研究領域中的應用,越來越多心腦血管疾病的致病基因被發現。ANXA6在肝臟、脾臟、肌肉和腸道中的分布濃度顯著高于其他組織,同時ANXA6定位于肝細胞的質膜上,在膽小管上的分布也較高[7]。ANXA6基因表達蛋白屬于鈣依賴性膜和磷脂結合蛋白家族,ANXA6蛋白以動態和可逆方式結合細胞膜中磷脂,在調節肝細胞的胞內和胞外轉運過程中發揮著重要作用。研究發現,ANXA6可作為膜結構域的組織者調節細胞內膽固醇穩態,通過參與胞吞和胞吐、質膜修復、信號轉導等細胞代謝過程維持膽固醇穩態[8-9]。本研究通過對不同性別人群ANXA6基因相關的SNP位點基因型分布特點進行分析,探討ANXA6基因變異與AST水平的相關性,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組本研究為橫斷面調查,選取2018年10-11月在新疆醫科大學健康體檢中心體檢的7 095名學生為研究對象。用機械身高計(德國Seca公司,Seca213)和電子體重秤(德國Seca公司,Seca877)按標準法測量身高和體重,分別精確至0.1 cm和0.1 kg,計算體重指數(Body mass index,BMI),BMI=體重(kg)/身高2(m2)[7]。按照體檢日期由小到大進行雙重編號,建立數據庫。由于低密度脂蛋白膽固醇為冠心病降血脂治療的靶點,本研究采用極端表型研究策略[10]對測定的不同性別人群低密度脂蛋白膽固醇水平進行從小到大的排序,并按照納入排除標準篩選后最終納入792例。分析納入人群的所有生化指標后發現門冬氨酸氨基轉移酶(AST)為ANXA6基因變異陽性指標,中位數為18.03 U/L。因此本研究將AST≤18.03 U/L作為對照組,AST>18.03 U/L作為病例組,對照組共納入400例,其中男性140例,女性260例;病例組共納入392例,男性217例,女性 175例。本研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批批準(審批號:K202011-06),參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 納入與排除標準納入標準:研究對象無呼吸系統、消化系統、內分泌系統疾病;無肝病、腎臟病、心腦血管系統疾病等疾病史;無任何傳染病病史;無家族性疾病史及其它相關病史手術史。排除標準:血液樣本非人為性破壞(如運輸、冷藏、提取失敗、凝固等);提取DNA后送測公司遺失樣本;測序過程中未測出樣本;總數據庫中基本信息及體檢數據缺失樣本。

1.3 檢測血液生化指標與提取DNA所有研究對象均于采血前一日凌晨禁食禁水,空腹8～10 h,于次日抽取肘靜脈血5 mL。其中的4 mL按照《血脂測定技術及其標準化的建議》的標準[11],檢測血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,Cr)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(TBIL)、空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。剩余1 mL用于提取血液樣本中的DNA,對合格的DNA樣品采用SNPscan技術進行基因型分型。采用連接酶鏈式反應的高特異性實現對SNP位點等位基因的識別。通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列及通過連接酶鏈式反應獲得位點對應的不同長度連接產物,利用標記熒光的通用引物對連接產物進行PCR擴增,通過熒光毛細管電泳對擴增產物進行電泳分離,GeneMapper軟件分析獲取SNP位點的基因型。

1.4 單核苷酸多態性位點的選擇及遺傳變異檢測從Hapmap數據庫中下載ANXA6相關基因序列,使用Haploview 4.2軟件檢測基因多態性位點,設置參數條件為r2>0.8,最小等位基因頻率(MAF)≥0.05,在NCBI網站上查看相關報告,并選擇rs2303022(SNP1)、rs2303027(SNP2)基因位點。采用SNPscan分型技術對上述SNP位點進行分型,對分型結果進行雙盲樣本和陰性對照質控,哈迪-溫伯格平衡(HWE)及MAF合理性的質檢。由于兩個基因均位于內含子上,且基因位點高度連鎖相關,因此只檢測rs2303022(SNP1)。

2 結果

2.1 病例組和對照組基線資料比較病例組和對照組性別分布、BMI、ALT、Cr、FBG、TC、LDL-C、HDL-C、TG水平比較,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。男性對照組和男性病例組在BMI、ALT、TC、LDL-C、TG水平上的差異有統計學意義(P<0.05);女性對照組和女性病例組在年齡和ALT水平上的差異有統計學意義(P<0.05),其余差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表1 病例組和對照組基線資料比較

表2 不同性別人群基線資料比較

2.2 病例組和對照組基因型和等位基因分布頻率比較病例組和對照組ANXA6基因rs2303022(SNP1)的基因型(CC;CG;GG)在隱性模型(CC+CG;GG)、顯性模型(CC;CG+GG)和類加模型(CC+GG;CG)中的分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)。男性對照組和男性病例組ANXA6基因rs2303022在隱性模型(CC+CG;GG)中的分布頻率差異有統計學意義(P<0.05),其余差異無統計學意義(P>0.05),見表3、4。

表3 病例組和對照組基因型、模型和等位基因分布頻率比較/例(%)

表4 不同性別人群基因型、模型和等位基因分布頻率比較/例(%)

2.3Logistic回歸分析在進行Logistic回歸分析前進行多重共線性診斷后發現各變量間不存在共線性。經校正年齡、BUN、TC、Cr、FBG、HDL-C、LDL-C、TBIL、TG、BMI、ANXA6(CC)、ANXA6(CG)、ANXA6(GG)、顯性基因模型(CC vs CG+GG)、類加基因模型(CC+GG vs CG)等影響因素后進行非條件性Logistic回歸分析,未發現自變量和因變量間存在明顯的線性關系,但ALT和AST水平呈正相關(OR=1.18,P<0.001,95%CI:1.14～1.22),見表5。在此基礎上使用向前選擇性Logistic回歸分析,同樣校正上述影響因素后發現,年齡和HDL-C水平是AST升高的影響因素,見表6。

表5 AST多因素非條件Logistic回歸分析

表6 AST向前選擇性多因素Logistic回歸分析

3 討論

人類ANXA6基因位于5號染色體短臂33.1的位置,共有26個外顯子,ANXA6基因長約60 kbp。它編碼一種約68 kDa的蛋白質,由68個氨基酸的重復序列組成,控制著內吞和胞吐中的膽固醇和膜轉運,并調節甘油三酯的累積和儲存[8]。研究發現,參與膽固醇轉運的ANXA6的減少可改善C型尼曼氏病(NPC)中NPC1突變細胞中的膽固醇積累,ANXA6缺陷不會逆轉神經和運動功能障礙,還會進一步惡化整體肝功能,加劇NPC疾病的肝功能衰竭[12-13]。目前,對ANXA6在膽固醇代謝中的作用及對肝酶影響的研究處于初級階段,研究ANXA6基因具體作用機制具有重要意義。

本研究結果顯示,病例組和對照組在性別分布上有差異,女性對照組和女性病例組在年齡上的差異有統計學意義,提示年齡和性別是影響血清肝功能相關酶活性的因素。本研究結果顯示,病例組和對照組ALT、FBG、TC、LDL-C、HDL-C、TG水平比較,差異有統計學意義。肝臟是糖代謝及膽固醇合成與代謝的重要器官,與血糖、血脂調節的關系十分密切。ALT和AST均源于肝細胞的胞漿中,是反映肝損傷的肝酶指標。研究表明,AST升高與胰島素抵抗、血糖升高及代謝綜合征(MS)相關疾病,如心血管疾病、動脈粥樣硬化等有關[14-15]。高夢圓等[16]的研究發現,AST、Cr水平升高的患者發生重癥和死亡風險均顯著升高,肝和/或腎功能損傷者發生重癥和死亡風險高于肝腎功能正常者,提示若出現肝功能損害和腎功能損傷,其重癥化傾向和死亡風險明顯升高,應進行早期干預。Zhang等[17]的研究發現,與TC基因型男性攜帶者比較,rs11960458的CC基因型男性攜帶者ANXA6表達較低以及TC、LDL和ApoB水平降低,說明ANXA6基因位點發生突變對不同性別人群的表型影響具有差異性。本研究顯示,男性對照組和男性病例組ANXA6基因rs2303022在隱性模型(CC+CG;GG)中的分布頻率差異有統計學意義(P<0.05),但未發現ANXA6基因SNP1(rs2303022)位點與AST相關。

顧穎慧[18]研究發現,ALT和AST的異常率隨年齡增長而下降。本研究顯示,年齡和HDL-C水平是AST升高的影響因素,提示肝臟功能受損同時可能伴有血脂異常。本研究樣本量相對較少,納入危險因素較少,未能用分子生物學技術對ANXA6進行基因表達及蛋白功能檢測,后期需進一步深入研究。