口腔扁平苔蘚患者外周血中IL-23R表達及其基因多態性與免疫功能的相關性研究

楊金國, 顧 娟

(鹽城市第三人民醫院/南京醫科大學鹽城臨床醫學院1口腔科, 2檢驗科, 江蘇 鹽城 224001)

扁平苔蘚感染是一種慢性炎癥免疫疾病,可累及皮膚、頭皮及指甲等多個部位,其中口腔扁平苔蘚(Oral lichen planus,OLP)最為常見,臨床發病率在0.5%～4%,以中年女性為高發人群[1]。OLP發病原因尚不確定,該病具有一定的家族聚集性,推測遺傳因素可能是OLP發病的原因[2-3]。研究顯示,復雜的細胞因子網絡系統失調引起免疫功能紊亂是OLP發病的重要機制,OLP病理表現為T細胞皮下浸潤及基底角質細胞變性,提示免疫相關細胞因子基因多態性可能與OLP易感性及免疫功能失調有關[4]。白細胞介素(Interleukin,IL)-23屬于IL-12家族,參與OLP、牛皮鮮、炎癥性腸病等多種慢性炎癥疾病的發生,是影響機體免疫功能的多功能細胞因子[5]。IL-23與IL-23受體(Interleukin-23 receptor,IL-23R)結合,才能激活下游輔助性T細胞17(Helper T cell 17,Th17)信號通路,發揮相關作用。IL-23R基因存在單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位點,且與多種免疫疾病的發生有關[6-7],但IL-23R基因多態性與OLP免疫功能的關聯性尚無定論。本研究分析IL-23R在OLP患者外周血中的表達及其基因多態性與患者免疫功能的關系,以期為OLP的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1至2022年11月鹽城市第三人民醫院/南京醫科大學鹽城臨床醫學院收治的90例OLP患者(OLP組),另選取同期45例健康體檢者為對照組。納入標準:(1)符合《口腔黏膜病學》[8]中的OLP診斷標準,并經病理檢查確診者;(2)個體間無親緣關系者;(3)年齡>18歲者;(4)首診,未接受治療者;(5)知情本研究并簽署同意書者。排除標準:(1)合并自身免疫性疾病、過敏性疾病者;(2)合并炎癥性腸病等其他慢性炎癥疾病者;(3)近期服用糖皮質激素、免疫抑制劑、抗生素者;(4)伴牙周炎等其他口腔疾病者;(5)妊娠期或哺乳期者。OLP組:男性35例,女性55例;年齡21～68歲,平均(49.60±8.14)歲;病程1個月～3.5年,平均(1.25±0.34)年。對照組:男性17例,女性28例,年齡22～75歲,平均(50.82±9.04)歲。OLP組與對照組在性別、年齡方面具有可比性(P>0.05)。

1.2 外周血IL-23R mRNA表達檢測采用含抗凝劑的真空管采集對照組及OLP組患者肘靜脈血8 mL,充分混勻后,分裝為3份,置于-20℃備用。取其中一份抗凝血,采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen)抽提總RNA,分光光度計測定RNA純度,并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定;采用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)合成互補鏈DNA(complementary strand DNA,cDNA),進行實時熒光定量聚合酶鏈反應,按照試劑盒設置20 μL反應體系,以95℃預變性5 min;38個循環(95℃ 15 s,58℃ 25 s,72℃45 s),2-△△Ct法計算IL-23R mRNA相對表達量。IL-23R引物序列:F:5′-ATGCTGTAGCTGATCGTGG-3′、R:5′-CTAGTCGTAGCTGACTAGC-3′,內參β激動蛋白(β-actin)引物序列:F:5′-ATGCTAGCGATGCTATGCTG-3′、R:5′-GC-GTAGCTGATGCTAGTCGT-3′。

1.3 外周血中IL-23R基因多態性檢測取一份抗凝血,采用全血基因組DNA快速提取試劑盒(美國Invitrogen)提取基因組DNA,分光光度計定量。單核苷酸多態性數據庫中選擇SNP位點,以最小等位基因頻率≥0.05作為篩選條件,選擇rs7517847、rs11465817兩個位點。多重聚合酶鏈反應法進行目的基因擴增(試劑盒購自日本TaKaRa),94℃5 min;38個循環(94℃ 45 s,58℃ 60 s,72℃60 s),rs7517847引物序列:F:5′-AGTACTGACTGATGCTTGG-3′、R:5′-ATGCTACTGATGCTGACC-3′;rs11465817引物序列:F:5′-ACCTACAGCCTAGACTCTGG-3′、R:5′-CTAGCTGGTAGCTGTACTGA-3′;回收擴增產物,送上海生工生物工程股份有限公司進行基因多態性分析。

1.4 外周血T淋巴細胞亞群及免疫球蛋白水平檢測取一份抗凝血,聚蔗糖密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),上Agilent NovoCyte流式細胞儀(安捷倫科技中國有限公司)檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+T細胞,抗體購自上海恒遠生物科技有限公司。另采集患者肘靜脈血2 mL,離心(3 200 r/min,10 min,R=12 cm)獲得上層血清,采用免疫透射比濁法檢測血清中免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)M、IgG、IgA水平,試劑盒購自中山標佳生物科技有限公司。

2 結果

2.1 OLP組與對照組IL-23R mRNA表達及免疫功能指標水平比較與對照組比較,OLP組CD3+、CD4+、CD8+T細胞比率降低,CD4+/CD8+、IgM及IL-23R mRNA表達量升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 OLP組與對照組免疫功能指標水平比較

注:與對照組比較, ***P<0.05。

2.2 IL-23R遺傳平衡檢驗結果IL-23R基因rs7517847位點基因型為TT/TG/GG,OLP組和對照組經檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.120,P=0.077;χ2=0.997,P=0.318);rs11465817位點基因型為CC/CA/AA,OLP組和對照組經檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.617,P=0.106;χ2=1.066,P=0.302),兩組具有群體代表性。

2.3 OLP組與對照組IL-23R各位點基因多態性比較OLP組與對照組患者外周血中IL-23R基因rs7517847位點等位基因頻率及基因型分布比較差異均無統計學意義(P>0.05);單因素Logistic分析顯示,等位基因T、G、基因型TT、TG、GG及隱性模型TG+GG均不增加OLP易感風險(P>0.05),顯性模型TT+TG患者OLP易感風險增加(OR=1.812,95%CI:1.056～3.229,P<0.05)。OLP組與對照組rs11465817位點等位基因頻率及基因型分布比較差異均有統計學意義(P<0.05);單因素Logistic分析顯示,等位基因C、基因型CC、CA、AA及顯性模型CC+CA均不增加OLP易感風險(P>0.05),等位基因A(OR=2.210,95%CI:1.261～4.104)及隱性模型CA+AA(OR=2.013,95%CI:1.124～3.094)患者OLP易感風險增加(P<0.05)。見表2。

表2 OLP組與對照組IL-23R各位點基因多態性比較/例(%)

2.4 OPL患者IL-23R不同風險基因型患者免疫功能指標的差異比較與rs7517847位點GG基因型患者比較,TT+TG患者CD3+、CD8+T細胞比率降低,CD4+/CD8+及IgM水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與rs11465817位點CC基因型患者比較,CA+AA患者CD3+、CD8+T細胞比率降低,CD4+/CD8+及IgM水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5 IL-23R基因多態性與免疫功能相關性分析Spearman相關性分析顯示,IL-23R基因rs7517847位點多態性與CD3+、CD8+T細胞比率呈正相關(r=0.276,P=0.009;r=0.297,P=0.005),與CD4+/CD8+及IgM水平呈負相關(r=-0.315,P=0.003;r=-0.420,P<0.001),與CD4+、CD16+CD56+、IgG、IgA無相關性(r=0.087,P=0.406;r=-0.007,P=0.949;r=0.037,P=0.733;r=0.165,P=0.120)。rs11465817位點多態性與CD3+、CD8+T細胞比率呈負相關(r=-0.298,P=0.004;r=-0.383,P<0.001),與CD4+/CD8+及IgM水平呈負相關(r=0.358,P<0.001;r=0.292,P=0.005),與CD4+、CD16+CD56+、IgG、IgA無相關性(r=0.126,P=0.237;r=-0.095,P=0.374;r=0.025,P=0.813;r=0.119,P=0.265)。見圖2。

注:左側為rs7517847位點基因型TT、T、GG,右側為rs11465817位點基因型CC、CA、AA。

3 討論

OLP發病原因尚不完全確定,可能與環境、內分泌、遺傳因素等有關[9]。Lu等[10]報道了8個中國家庭的OLP呈現家族遺傳性,其特點是發病年齡及病變分布類似。Wang等[11]報道1例3歲OLP患兒,其父母均有OLP病史。這說明遺傳因素可能是OLP發病的重要病因。對候選基因分析發現,OLP發病可能與某腫瘤壞死因子、白細胞介素及受體家族等基因SNP位點有關[12-13]。IL-23R作為IL-23的受體受到廣泛關注,已有報道證實IL-23R基因多態性對類風濕性關節炎、胃炎的發病產生影響[14-15]。OLP也屬于自身免疫性疾病,其特征是機體免疫耐受的失衡,由自身Th1、Th17細胞驅動,而IL-23R是調控免疫耐受的關鍵受體之一。因此探討IL-23R在OLP中的表達及其SNP位點與免疫功能的關系對疾病臨床防控有重要意義。

本研究發現,OLP組CD3+、CD4+、CD8+T細胞比率均低于對照組,CD4+/CD8+、IgM及IL-23R mRNA表達量均高于對照組,提示OLP患者免疫功能下降,IL-23R表達上調。IL-23R定位于1號染色體,與表達于NK細胞及T細胞表面的IL-12Rβ1形成受體復合物,與IL-23結合發出激活信號,從而參與調節幼稚CD4+T細胞向Th17分化,并在維持Th17細胞活性、促進細胞因子分泌方面發揮重要作用[16]。Kumaran等[17]研究發現,IL-23R mRNA在皮膚扁平苔蘚患者中表達量升高,且與疾病活動度有關,與本研究結果相似。吳豐蘇等[18]研究顯示,rs11465817位點SNP的風險基因使復發性口腔潰瘍發生風險增加(OR=3.44)。本研究發現檢測IL-23R基因SNP位點發現,rs7517847位點顯性模型TT+TG(OR=1.812)及rs11465817位點等位基因A(OR=2.210)及隱性模型CA+AA(OR=2.013)患者OLP易感風險均明顯增加,提示IL-23R基因rs7517847、rs11465817多態性與OLP易感性存在關聯。

本研究發現,TT+TG及CA+AA基因型患者CD3+、CD8+T細胞比率分別低于GG和CC患者,CD4+/CD8+及IgM水平分別高于GG和CC患者,提示IL-23R基因SNP位點不同風險基因型患者存在免疫功能的差異。分析發現,rs7517847、rs11465817位點雖然均位于內含子上,但可能與多個功能位點發生連鎖效應,其A等位基因能夠增加轉錄穩定性,導致IL-23R mRNA表達量上調,最終導致局部發生免疫功能紊亂[19]。本研究相關性分析發現,rs7517847和rs11465817位點多態性均與CD3+、CD8+T細胞比率、CD4+/CD8+及IgM水平具有相關性,提示rs7517847和rs11465817位點可能與OLP患者機體免疫功能存在關聯。遺傳學指出,不同基因型可以決定臨床表型,若某中間表型代表暴露特征,則該基因型能夠模擬暴露因素與疾病的關聯效應[20]。由遺傳學理論可以推測,IL-23R基因rs7517847位點TT+TG基因型和rs11465817位點TT+TG基因型能夠反映OPL患者免疫功能紊亂的表型,從而增加疾病易感性風險。

綜上所述,OLP患者外周血中IL-23R mRNA表達水平高于健康人群,這可能是免疫紊亂的表現,IL-23R基因rs7517847、rs11465817多態性與OLP易感性及患者的免疫功能密切相關,為OLP病因探索及臨床防控提供更多遺傳學支持。