A型肉毒毒素基于TGF-β1/MAPK 通路抑制增生性瘢痕的體外實(shí)驗(yàn)研究

馬 娟, 余 揚(yáng), 于 揚(yáng), 張 波, 董祥林

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形科, 烏魯木齊 830054)

增生性瘢痕(Hypertrophic scar, HS)的組織學(xué)特征為成纖維細(xì)胞(Fibroblast,FB)過(guò)度增生和細(xì)胞外基質(zhì)( Extracellular matrix,ECM) 過(guò)度沉積,屬于皮膚纖維增生性疾病[1-3],但增生性瘢痕的形成機(jī)制尚未完全明確。目前對(duì)其預(yù)防和治療策略主要分為:非手術(shù)治療包括外用硅酮凝膠貼片[4]、外用皮質(zhì)類固醇貼劑、瘢痕內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇[5]、瘢痕內(nèi)注射5-氟尿嘧啶[6]、口服藥物(如普萘洛爾和氧甲氫龍)[7];手術(shù)治療包括手術(shù)切除、松解瘢痕等。雖然瘢痕治療的方式種類繁多,但治療多停留于功能層面,患者即使功能得以恢復(fù),因瘢痕存在對(duì)容貌的損害和心理的負(fù)面影響,仍無(wú)法回歸正常的工作和生活。如何將預(yù)防與治療達(dá)到功能和美觀并重,促進(jìn)患者回歸正常生活、提高生活質(zhì)量是進(jìn)一步努力的方向[8]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是已明確可誘導(dǎo)體內(nèi)纖維化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,其表達(dá)增強(qiáng)是病理性瘢痕產(chǎn)生的重要原因,蛋白激酶(MAPK)通路是其下游的非典型通路,p38/MAPK是其中一個(gè)通路[9]。有研究顯示p38/ MAPK通路的激活與腎纖維化相關(guān),在小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型和人IgA腎病活檢標(biāo)本中觀察到磷酸化的p38(P-p38)與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān),抑制p38/ MAPK可防止腎纖維化的進(jìn)展[10]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),A型肉毒毒素能夠通過(guò)抑制ERK/MAPK信號(hào)通路而使得成纖維細(xì)胞凋亡增加,增殖活性減弱,Ⅰ型膠原蛋白分泌減少[11]。本研究分析BTXA對(duì)體外增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用及對(duì)P38/MAPK通路的影響,探究BTXA抑制增生性瘢痕形成的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年2月-2021年10月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形科收治的12例增生性瘢痕患者手術(shù)切除的廢用瘢痕組織,患者年齡7～45歲,男性4 例,女性8 例。所有患者臨床及病理診斷均為增生性瘢痕,瘢痕處均未接受過(guò)其他治療。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核,所以患者及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 藥物及試劑A型肉毒毒素(蘭州衡力公司),p38MAPK抑制劑SB202190(北京索萊寶公司) , TGF-β1(Protech 公司),高糖DMEM (美國(guó) Hyclone公司 ),胎牛血清(美國(guó)Gibco公司), 青鏈霉素雙抗溶液(美國(guó)Hyclone公司),Collagen Ⅰ、p38/p-p38抗體(美國(guó)Abcam公司),羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng),在無(wú)菌條件下獲取手術(shù)切除的增生性瘢痕組織,去除組織表皮和脂肪,剩余組織進(jìn)一步修剪成0.7×0.7 cm2大小的組織塊,用含3%雙抗的PBS漂洗3～5遍,以合適間距放入10 cm培養(yǎng)皿中,放入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱固定2 h,待組織塊貼壁后加入8～10 mL完全培養(yǎng)基(含10%FBS+1%雙抗)。當(dāng)培養(yǎng)基由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色或黃色,每3天換液1次,鏡下觀察待細(xì)胞爬出融合至85%～90%,即可將組織塊移入新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)固定和培養(yǎng),爬出的原代細(xì)胞用0.25%胰酶消化后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4 CCK8試驗(yàn)取“1.3”項(xiàng)下培養(yǎng)的增生性成纖維細(xì)胞以80%的密度接種于96孔板,分為空白對(duì)照組(0 u/mL),2、4、8、10 u/mL BTXA5組[12],分別加入0、2、4、8、10 u/mL BTXA的培養(yǎng)基孵化24 h后,吸去原培養(yǎng)基,加入100 μL新鮮培養(yǎng)基,向每孔加入10 μL的CCK8試劑后,放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。按公式:抑制率=[(OD空白對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)]/OD空白對(duì)照組×100%計(jì)算不同藥物濃度對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制率。

1.5 細(xì)胞遷移能力-劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSFbs細(xì)胞懸液以2.5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后鏡下觀察細(xì)胞均勻分布且生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí),分別加入0、2、4、8、10 u/mL BTXA的培養(yǎng)基,用10 μL槍頭行劃痕試驗(yàn),即時(shí)拍照,24 h后同一區(qū)域拍照,以ImageJ軟件測(cè)量其劃痕內(nèi)空白面積,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 細(xì)胞因子檢測(cè)-Western blot實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSFbs細(xì)胞懸液以2.5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中,待貼壁24 h后,吸去原培養(yǎng)基,將細(xì)胞分為:空白對(duì)照組(加完全培養(yǎng)基2.5 mL)、TGF-β1組(加入含TGF-β1濃度為5 ng/mL的培養(yǎng)基2.5 mL)、BTXA組(加入含BTXA濃度為8 u/mL的培養(yǎng)基2.5 mL)、TGF-β1+BTXA組(加入含TGF-β1濃度為5 ng/mL及BTXA濃度為8 u/mL的培養(yǎng)基2.5 mL) 、TGF-β1+SB202190 組(加入含TGF-β1濃度為5 ng/mL及SB202190濃度為3 μmol/L的培養(yǎng)基2.5 mL),其中細(xì)胞在加入p38抑制劑SB202190孵化2 h后再加入TGF-β1。放入37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,收集干預(yù)完畢的各組細(xì)胞,收集蛋白,以BCA 法測(cè)定蛋白濃度和均一化,行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗4℃過(guò)夜。加入二抗,室溫孵育2 h后,化學(xué)發(fā)光法顯影,使用Image J 軟件分析條帶灰度值,計(jì)算檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CCK8試驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較,各濃度BTXA組成纖維細(xì)胞增殖均受到抑制,細(xì)胞增殖抑制率隨BTXA的濃度升高而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),當(dāng)BTXA濃度為8 u/mL時(shí),其對(duì)增生性瘢痕成纖細(xì)胞的抑制率為59%,說(shuō)明一半左右細(xì)胞被抑制,故選用8 u/mL的BTXA濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),見(jiàn)表1。

表1 成纖維細(xì)胞增殖抑制率及劃痕缺損面積

2.2 不同濃度BTXA培養(yǎng)基對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞遷移能力的影響與空白對(duì)照組比較,4、8、10 u/mL BTXA組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著B(niǎo)TXA培養(yǎng)基濃度的增高,其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞遷移能力的抑制作用越明顯,見(jiàn)表1。

2.3 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中各種因子的影響與空白對(duì)照組比較,TGF-β1組可明顯增強(qiáng)BCL-2及COL-1的表達(dá), BTXA組可下調(diào)BCL-2及COL1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TGF-β1組比較,TGF-β1+BTXA組與TGF-β1+SB202190組均可明顯降低BCL-2及COL1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2、圖1。

圖1 HSFbs藥物干預(yù)后COL-1、BCL-2的蛋白水平電泳圖

表2 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中各種因子的影響

2.4 BTXA對(duì)成纖維細(xì)胞中MAPK通路中P-p38的磷酸化產(chǎn)物變化影響與空白對(duì)照組比較,TGFβ1的P-p38明顯升高,此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組對(duì)照比較,BTXA 組的P-p38明顯減低,此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以TGF-β1組作為陽(yáng)性對(duì)照組,與TGF-β1組相比,TGF-β1+BTXA及TGF-β1+SB202190組的P-p38均明顯降低,此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表2,圖2。

圖2 HSFbs藥物干預(yù)后P38及P-p38蛋白水平電泳圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)BTXA對(duì)增生性成纖維細(xì)胞在形態(tài)、增殖、遷移方面有影響,BTXA可以明顯抑制增生性成纖維細(xì)胞的增殖,并隨著藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)。Western blot顯示BTXA能顯著抑制I型膠原蛋白的生成,抑制BCL-2的合成。回薔等[13]研究發(fā)現(xiàn)BTXA能夠抑制HSFBs的增殖、轉(zhuǎn)移能力,降低成纖維細(xì)胞中TGF-β1及其下游蛋白的表達(dá)形成。Zhou等[14]研究觀察到內(nèi)鏡下注射BTXA可有效預(yù)防內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)后食管狹窄,而劉曉鶴等[15]在對(duì)新西蘭雄兔醫(yī)源性急性熱損傷后的前尿道局部注射BTXA溶液,發(fā)現(xiàn)其可減緩?fù)媚虻廓M窄的發(fā)生。以上研究顯示BTXA在食管、尿道損傷后出現(xiàn)瘢痕纖維化改變?cè)斐傻莫M窄有緩解作用,這一結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果顯示BTXA通過(guò)MAPK通路可以起到抑制HSFbs的作用[16]。 MAPK包括ERK、p38和JNK 3個(gè)通路,目前關(guān)于BTXA抑制纖維化作用有通過(guò)ERK、JNK通路的研究,但P38MAPK通路暫無(wú)報(bào)道。根據(jù)既往研究,p38MAPK的活化產(chǎn)物 P-p38參與膠原合成,阻斷p38通路時(shí)則阻止了膠原的mRNA表達(dá)。例如肝纖維化中,可觀察到異鼠李素通過(guò)下調(diào)TGF-β1介導(dǎo)Smad3和p38/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)從而抑制ECM的形成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)BTXA可抑制P-p38的表達(dá),說(shuō)明BTXA可抑制P38的磷酸化。TGF-β1可促進(jìn)HSFbs中P-p38的表達(dá),加入BTXA和P38抑制劑SB202190后,發(fā)現(xiàn)TGF-β1+BTXA組及TGF-β1+SB202190組的P-p38表達(dá)均低于TGF-β1組, 進(jìn)一步說(shuō)明BTXA可抑制p38的磷酸化過(guò)程,抑制P38/MAPK通路。

綜上所述,BTXA通過(guò)抑制HSFbs的增殖及p38/MAPK通路的磷酸化,而負(fù)向影響B(tài)CL-2的表達(dá)并抑制COL1的生成,達(dá)到預(yù)防與治療增生性瘢痕的作用。