泛癌中FGFR3表達的預后意義及其免疫調節作用*

許怡冉，何玥，李冕，魯艷芹,3

（1.山東第一醫科大學 臨床與基礎醫學院，山東 濟南 250117；2.山東第一醫科大學 生物醫學科學學院，山東 濟南 250117；3.山東第一醫科大學第一附屬醫院 內分泌科，山東 濟南 250014 ）

FGFR3 基因屬于受體酪氨酸激酶（FGFR）家族，位于人類染色體4p16.3，長約16.5 kb，是一種具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體。與配體結合后形成二聚體激活胞內酪氨酸激酶，在細胞內引起一系列級聯反應，導致DNA 合成和細胞分裂［1］，并進一步激活下游MAPK 及PI3K/AKT 信號通路。其中細胞內MAPK 信號通路與腫瘤細胞增殖、遷移和轉移行為相關；PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細胞遷移、黏附及腫瘤血管的生成相關［2］。FGFR3 突變多發生在細胞外結構域（R248C,S249C），突變產生的新半胱氨酸殘基可與受體二聚體共價結合，導致受體的結構性激活來參與腫瘤的發生。研究表明，約有35%膀胱癌及25%宮頸癌病例中發生了FGFR3 的基因突變，突變主要發生在淺表或乳頭狀低級別膀胱癌中，與良好的預后及臨床分期相關［3-5］。基于大量的文獻檢索與臨床數據，目前仍缺乏FGFR3 與各種腫瘤關系的泛癌證據。該研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus,GEO）中數據［6-8］分析基因表達、生存預后、免疫微環境和相關蛋白通路的分子特征，研究FGFR3 基因在不同腫瘤發病機制中臨床預后及免疫相關性，為探討潛在的腫瘤免疫治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 基因表達分析

利用TIMER2［9］數據庫（http：//timer.cistrome.org//）中“Gene-DE”模塊分析FGFR3 在正常組織與腫瘤組織間表達差異，評估FGFR3 具有治療靶標的潛力。對于缺乏正常組織對比數據的腫瘤，利用GEPIA2［10］數據庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/index.html#index）的“Expression Analysis”模塊分析，設置“P值=0.01，log2FC=1”，獲得這些腫瘤組織與GTEx 數據庫中對應的差異數據。通過GEPIA2 網站的“Stage Plot”模塊分析多種不同病理分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）腫瘤組織中FGFR3 基因表達，用log2（TPM+1）轉換后的數據作出“小提琴圖譜”。

1.2 生存預后分析

利用GEPIA2“Survival Analysis”模塊獲得TCGA腫瘤中包含FGFR3 基因的腫瘤總體生存率（overall survival,OS）和無病生存率（disease free survival,DFS）數據圖譜，設置表達參數“cutoff-hight（50%），cutoff-low（50%）”區分高表達組和低表達組。假設檢驗采用Mentel-Cox 檢驗，通過GEPIA2 的“Survival Analysis”模塊繪制單基因生存分析圖（Kaplan-Meier）。

1.3 基因變異分析

利 用 cBioPortal［11］數據庫（https：//www.cbioportal.org/）中“Quick Search”模 塊，選擇TCGA 泛癌圖譜分析，輸入FGFR3 進行泛癌基因突變匯總，并在“Mutation”模塊查詢FGFR3 的基因突變頻率，突變類型，拷貝數改變（CAN）、突變位點及蛋白質三維結構。利用“Comparison/Survival”模塊獲得FGFR3 基因在突變及未突變時，TCGA 腫瘤病例中無疾病的、無進展的和無疾病生存差異的總體數據，同時生成P值為log-rank的Kaplan-Meier 圖。利用Rstudio 中TCGAbiolinks軟件包下載突變注釋文件，利用Spearman 相關性檢驗評估FGFR3 表達與TMB、MSI 間的相關性，使用配對t檢驗進行基因共表達分析。

1.4 免疫浸潤分析

TIMER2 提供六種常見免疫細胞的滲透評分，包括B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞。利用Immune 模塊分析TCGA 腫瘤中FGFR3 表達與免疫浸潤之間的關系，采用XCell、MCPCOUNTER 和EPIC 算法進行免疫浸潤評估。腫瘤純度是本分析中的主要混雜因素［12］，通過純度調整后的Spearman's 等級相關檢驗得到P值及偏相關系數（partial correlation,COR）值。數據以熱圖及散點圖的形式展現。

1.5 FGFR3 相關基因的富集分析

通過 GEPIA2 數據庫的“Similar Gene Detection”模塊，得到與FGFR3 表達相關的前100 個靶向基因，應用log2TPM 方塊圖，得到P值和相關系數R，利用以上數據制作所選基因與FGFR3 的相關性熱圖。STRING 數據庫是一個檢索已知蛋白及預測蛋白間相互作用的數據庫［13］（https：//string-db.org/），通過“Protein by name”模塊，輸入蛋白名稱“FGFR3”，隨后設置以下參數：最低交互分數設置為低信度0.150；最大交互對象數量設置為不超過50 個；來源設置為實驗。篩選出50 個經實驗驗證的FGFR3 結合蛋白。使用Venn［14］網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將相關性前100 基因與蛋白互作的50 個基因進行交叉分析。結合兩組數據進KEGG 和GO 通路分析。將基因列表上傳到David網 站［15］（https：//david.ncifcrf.gov/）并選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“Homo Spaiens”分別作為基因標識符和物種，使用cnetlot 函數（Circle=F,ColorEdge=T,Node_Label=T），對生物學過程的分子功能（molecular function,MF）數據通過ggplot2 和ForestPlot 的R 包生成cnet 曲線圖［16］。其中，雙側P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因表達分析

在本研究中，筆者探討人類FGFR3 基因（mRNA：NM_000142.5，蛋白質 ：NP_001341738.1）的致癌作用。系統發育樹分析FGFR3 蛋白在不同物種間的進化關系，篩選出相似度最高的14 個物種進行同源分析，發現智人與黑猩猩，白頰長臂猿關系最近。

采用TIMER2 數據庫分析TCGA 中FGFR3 mRNA 表達水平。在乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、肝細胞肝癌（LIHC）、肺鱗癌（LUSC）、皮膚黑色素瘤（SKCM）、甲狀腺癌（THCA）組織中FGFR3mRNA 表達水平明顯高于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.001）。在結腸癌（COAD）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）組織中FGFR3mRNA 表達水平明顯低于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖1A。

圖1 FGFR3 基因在不同腫瘤和病理分期中的表達水平

將TCGA 與GTEx 數據庫聯合分析，補充GTEx 數據集的正常組織作為對照，進一步分析FGFR3 在卵巢漿液性囊腺癌（OV）、胸腺癌（THYM）、子宮肉瘤（UCS）、急性髓細胞樣白血病、（LGG）、睪丸癌（TGCT）的正常組織和腫瘤組織中的表達差異（P＜0.01），見圖1B。對于腎上腺皮質癌（ACC）、彌漫性大B 細胞淋巴瘤（DLBC）和肉瘤（SARC）差異無統計學意義（P＞0.05）。

使用GEPIA2 中“Pathological Stage Plot”模塊觀察腫瘤中FGFR3 表達與臨床分期間相關性，包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、腎透明細胞癌、腎嫌色細胞癌、肺腺癌、皮膚黑色素瘤和子宮內膜癌（UCEC），發現上述腫瘤中FGFR3 表達普遍呈上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C。

2.2 生存預后分析

根據FGFR3 表達水平，將腫瘤劃分為高表達組和低表達組。如圖2A 所示，FGFR3 高表達與腎透明細胞癌（P=0.014）總體預后不良有關，低表達的FGFR3 與腎上腺皮質癌（P=0.012）和LGG（P=0.034）總體預后不良有關。無病生存率分析數據顯示FGFR3 的高表達與頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）（P=0.0067）患者預后差有關，低表達的FGFR3 與腎上腺皮質癌（P=0.015）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）（P=0.0067）患者預后差有關（見圖2B）。上述結果表明FGFR3 的表達高低與不同類型腫瘤的預后存在差異。

圖2 FGFR3 基因與腫瘤生存預后的關系

2.3 基因突變分析

以FGFR3 突變為主要類型的膀胱尿路上皮癌患者，FGFR3 基因的變異頻率最高（＞18.73%），子宮肉瘤以FGFR3 擴增為主，其變異頻率＞15.79%，FGFR3 擴增是腎上腺皮質癌和膽管癌患者的唯一變異類型，其變異頻率＞2%（見圖3A）。進一步顯示FGFR3 基因變異的類型和位點（見圖3B），發現FGFR3 錯義突變是遺傳變異的主要類型，在1 例KRPCC、4 例LSCC、4 例頭頸鱗狀細胞癌、32 例LUCC 病例中檢測出I-set 結構域中使FGFR3基因249 號位點發生拼接突變（見圖3C）。

圖3 TCGA 腫瘤中FGFR3 基因突變特征及基因共表達分析

評估FGFR3 表達與不同腫瘤類型的TMB 之間的關系，發現FGFR3 表達與膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、結腸癌、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肺腺癌、間皮瘤（MESO）、皮膚黑色素瘤、胸腺癌中的TMB 相關，而與其他腫瘤無顯著相關（見圖3D）。此外，評估了不同腫瘤中FGFR3 表達與MSI 狀態之間的關系，發現FGFR3 表達與肺腺癌、卵巢漿液性囊腺癌、胰腺癌（PAAD）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、子宮內膜癌、葡萄膜黑色素瘤、結腸癌、腎透明細胞癌中的MSI 相關，而與其他腫瘤無明顯相關性（見圖3E）。

2.4 免疫浸潤分析

使用不同算法研究免疫細胞浸潤水平與FGFR3 表達間的相關性。基于全部結腸癌、頭頸鱗狀細胞癌、胰腺癌、前列腺癌和睪丸癌各腫瘤中FGFR 的表達與腫瘤相關成纖維細胞的浸潤水平呈負相關，FGFR3 表達與卵巢漿液性囊腺癌相關成纖維細胞呈正相關（圖4A）。在此，將上述腫瘤其中一種算法產生的相關性散點圖作為代表展現（圖4B,Rho=-0.391,P=1.00e-06）。

圖4 FGFR3 基因表達與癌相關成纖維細胞免疫浸潤分析

2.5 FGFR3 相關基因的富集分析

為了進一步研究FGFR3 基因在腫瘤發生中的分子機制，篩選出FGFR3 靶向結合蛋白及FGFR3表達相關基因進行一系列富集分析。采用STRING數據庫，得到50 個基于實驗數據支持的FGFR3結合蛋白。圖5A 為這些蛋白相互作用網絡。使用GEPIA2 工具結合TCGA 腫瘤的表達數據，得到FGFR3 表達相關的前100 個基因。圖5C 所示，FGFR3 表達水平與ARHGAP23（R=0.33）、LET（R=0.31）、PVRL1（R=0.34）、SDC1（R=0.32）和TACC3（R=0.4）基因的表達水平呈正相關（P＜0.001）。相應熱圖數據顯示FGFR3 在不同腫瘤中的表達差異性（圖5D）。將蛋白互作的50 個基因與相關性前100 基因取交叉分析篩選出共同基因PVRL1（圖5B）。

結合上述兩組數據集進行KEGG 和GO 富集分析。KEGG 數據表明，FGFR3 在腫瘤發病機制中的作用可能與腫瘤信號通路（pathways in cancer）、MAPK 信號通 路（MAPK signaling pathway）和 PI3K-Akt 信號通 路（PI3K-Akt signaling pathway）有關（圖5E）。GO 富集分析進一步表明，這些基因大多數與細胞增殖、分化及血管形成途徑密切相關（圖5F）。

3 討論

通過文獻檢索，筆者沒有檢索到任何從整體角度對FGFR3 進行泛癌分析的文獻。本文首次系統地通過生信分析發現FGFR3 在肝癌、睪丸癌等腫瘤組織中高表達，在肺腺癌、結腸癌、子宮肉瘤等組織中低表達。FGFR3 基因在肝癌中高表達，且其高表達和肝癌的惡性程度密切相關［17］。數據顯示，肝癌是全球第五大癌癥相關死亡原因，在我國其死亡率位居惡性腫瘤第2 位。全球每年新發肝癌病例85.4 萬例，中國46.6 萬例，約占全球的55%［18］，因而研究與開發肝癌特異性靶點藥物在我國更加具有重要的意義。FGFR3 通過自分泌或旁分泌機制促進肝癌細胞的生長，但肝癌中信號通路間常存在廣泛的交叉，FGF 信號通路聯合其他途徑將是今后研究的重要方向［19］。睪丸癌是一種多發于青壯年男性的惡性泌尿系統腫瘤，近年來其發病呈上升的趨勢［20］。生信研究顯示FGFR3 在睪丸癌中表達顯著高于正常組織，其高表達與睪丸癌患者預后不良有關。FGFR3 信號在嬰兒期和青春期前的精原細胞中活躍，并與磷酸化受體向細胞核的移位有關，FGFR3 信號促進精原細胞存活和增殖，在激活該途徑突變的情況下導致睪丸癌的發生［21］。由于睪丸腫瘤比較少見，占泌尿系統腫瘤的5%［20］，在臨床上關于睪丸癌的研究鮮有報道，睪丸癌在診斷、治療、預后等方面缺乏敏感性與特異性的理想腫瘤標志物，因此，利用生物信息學手段，尋找特異性較高的睪丸癌標志物具有重要的臨床意義，FGFR3 可能成為睪丸癌新的預后標志物及診療的潛在靶點。已有文獻證實，FGFR3 基因是肺癌細胞轉移的重要標志物，FGFR3 基因通過參與RAS/RAF/MEK/MAPK途徑及促進上皮間質轉化而促進肺癌的轉移［22］。中國每年預計新增肺癌病例約70 萬，新增肺癌死亡病例約40 萬［23］。近期研究表明FGFR3 基因沉

默介導的基質金屬蛋白酶9 下調可明顯抑制肺癌細胞A549 的侵襲能力［24］。生信分析發現FGFR3高表達與肺癌患者OS、PPS、FP 預后不良有關，表明FGFR3 可能成為肺癌新的診療靶點和有效分子預后標志物。FGFR3 在結腸癌中低表達，是重要的腫瘤負調節因子。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，調查顯示2021 年結腸癌為全球癌癥死亡的主要原因［25］。研究表明FGFR3 表達抑制了結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過阻斷FGFR3-IIIc 信號傳導促進了結腸癌細胞凋亡［26］。表明FGFR3 有望成為治療結腸癌的潛在靶點，可能是結腸癌預后的重要分子標志物。

惡性腫瘤的最大標志是不受控制的細胞增殖，酪氨酸激酶在增殖信號的轉導上有重要作用，當它由于體內突變使得調節異常時，可以促進腫瘤的發生。以往人們對FGFR3 突變的研究主要圍繞骨發育相關的人類遺傳病，如FGFR3 特殊位點突變導致軟骨發育不良［27］。近年來國外研究表明，FGFR 作為酪氨酸家族的一員，證實與腫瘤的發展密切相關［28］，尤其在膀胱癌中。生信分析觀察到，FGFR3 最主要的變異類型是錯義突變，在膀胱尿路上皮癌中突變頻率最高（＞18.73%），FGFR3 的表達與膀胱尿路上皮癌患者的腫瘤突變負荷具有相關性，并且與大多數免疫點基因呈負相關。膀胱癌是發病率較高的癌癥類型［29］，已有實驗證實，FGFR3 突變與膀胱癌預后差有關［30］，FGFR3 突變能預測肌層浸潤性膀胱癌術前新輔助化療的療效［31］，說明FGFR3 是膀胱癌重要的治療和預后分析輔助標志物。分析發現FGFR3 在子宮肉瘤中的變異頻率同樣較高（＞15.79%），FGFR3 在子宮肉瘤中低表達，并且其擴增與子宮肉瘤預后差有關。子宮肉瘤是一類惡性間葉組織源性腫瘤，預后較差［32］，研究證實，RB1、TP53 和PTEN 是子宮肉瘤的重要分子標記物，子宮平滑肌肉瘤患者中TP53 突變的頻率為24%～30%，PTEN 突變的頻率為42%～58%［33］。因此FGFR3 也可能成為子宮肉瘤的新的診斷和預后分子標志物，這需要在前瞻性的臨床試驗中加以評估。

阻斷免疫檢查點途徑是腫瘤免疫的有效措施，分析發現，在膀胱尿路上皮癌、結腸癌和睪丸癌中FGFR3 高表達與絕大部分檢查點基因表達水平呈顯著負相關，表明FGFR3 可能參與多種腫瘤的免疫調節。這些檢查點基因的上調可能與FGFR3誘導MAPK/ERK 通路，引起的免疫細胞分化和極化有關。在結腸癌、睪丸癌中FGFR3 表達與腫瘤相關成纖維細胞的免疫滲透水平呈負相關。因此，FGFR3 不僅是腫瘤潛在的預后預測因子，還可能是重要的腫瘤免疫調節因子。

綜上所述，FGFR3 的靶向免疫治療研究尚處于初級階段，很多問題仍然存在，如某些突變使得酪氨酸激酶耐藥性的出現及MAPK/ERK 信號網絡的代償性作用，均可使FGFR3 的分子靶向治療出現阻礙。因此，以FGFR3 為靶向的腫瘤基因治療在臨床上的應用價值尚待探索。通過FGFR3 的泛癌分析，有助于從臨床角度理解FGFR3 在腫瘤發生發展中的作用，為臨床診斷治療提供新的思路。