糖尿病腎病患者血清N/OFQ、IL-6的表達變化及相關(guān)性分析

柴丹 韓毅 侯文飛

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的首位病因,其患病率的增加與全球范圍內(nèi)糖尿病患病率的急劇上升相平行,大約40%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者會出現(xiàn)這種微血管并發(fā)癥[1,2]。DKD的發(fā)病機制尚不明確,目前普遍認為其發(fā)生與代謝紊亂[3]、氧化應(yīng)激[4]、免疫炎性[5]、遺傳因素[6]、自噬[7]等多種因素有關(guān)。越來越多的流行病學(xué)和臨床前證據(jù)表明炎性質(zhì)反應(yīng)在DKD的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[8]。在DKD相關(guān)炎癥因子中,白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)與其關(guān)系最為緊密,因其介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷,刺激腎小球硬化和腎小管間質(zhì)炎癥及纖維化[9]。內(nèi)源性孤啡肽(nociceptin/orphanin FQ,N/OFQ)是感覺神經(jīng)肽的一種,N/OFQ及其受體參與炎癥相關(guān)信號通路,誘導(dǎo)IL-6高表達[10],且在血管內(nèi)皮細胞具有高親和力結(jié)合位點,與多種大血管及微血管疾病有關(guān)[11],筆者發(fā)現(xiàn),鮮有N/OFQ與DKD的相關(guān)性研究。本研究通過觀察血清N/OFQ、IL-6在DKD患者中的水平變化,分析二者與DKD的相關(guān)性,旨在為DKD的早期識別和診治提供新的理論依據(jù)。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年3月至2022年3月于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院確診的T2DM患者180例,其中男96例,女84例;年齡(58.31±1.54)歲;均符合1999年世界衛(wèi)生組織提出的糖尿病診斷標準和分型[12]。DKD采用2021年糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南中的診斷標準,即腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)<60 ml·min-1·1.73 m-2和(或)尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio,ACR)≥30 mg/g持續(xù)>3個月[13]。根據(jù)ACR將180例患者分為正常白蛋白尿組60例(ACR<30 mg/g)、微量白蛋白尿組60例(30 mg/g≤ACR≤300 mg/g)和大量白蛋白尿組60例(ACR>300 mg/g)。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準(2021-YX第059號),患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準:(1)根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織公布的糖尿病診斷和分型標準,確診為T2DM的患者;(2)年齡30～70歲,相互無親緣關(guān)系。排除標準[14]:(1)原發(fā)性腎臟疾病者(例如:急慢性腎小球腎炎、免疫性及遺傳性腎病、腎盂腎炎、痛風(fēng)相關(guān)性腎病等);(2)其他因素所致尿微量白蛋白與尿糖異常改變者(例如泌尿系統(tǒng)感染、發(fā)熱、24 h內(nèi)有劇烈運動、頑固性高血壓、充血性心力衰竭、妊娠、酮癥酸中毒等);(3)伴全身其他重要臟器(心、肺、肝)功能衰竭;(4)尿沉渣有活動表現(xiàn);(5)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物開始治療后2～3個月內(nèi)GFR下降>30%;(6)癌癥、創(chuàng)傷、應(yīng)激及其他內(nèi)分泌疾病的患者;(7)1型糖尿病及腎損傷患者;(8)先天性智力障礙或依從性較差者。

1.3 方法

1.3.1 樣本量計算:采用公式n1=n2=2[(μα+μβ)/(δ/σ)]2+1/4μ2α進行計算,n1和n2分別為DKD組和糖尿病腎病組所需含量;δ=μ1-μ2,為兩總體均數(shù)之差值,σ為總體標準差(此處假設(shè)兩總體標準差相等);μα和μβ分別為檢驗水準α和Ⅱ型錯誤概率β相對應(yīng)的值。此處α取雙側(cè),μα=μ0.05/2=1.96;β取單側(cè),μβ=μ0.01=1.28。本研究未指定δ,因此對δ/σ進行適當假定,此處假定δ/σ=0.60,則本研究樣本量計算如下n1=n2=2[(1.96+1.28)/0.6]2+1/4×1.962=111.396≈60。

1.3.2 生化指標檢測:所有患者于入院第2天抽取非輸液側(cè)肘靜脈血進行生化檢測,并收取24 h 尿液用于檢測尿微量白蛋白(mALB)和肌酐(Scr)水平,計算其估算腎小球濾過率(eGFR)、ACR。采用高壓液相法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。使用 Sysmex 全自動血樣分析儀(日本 Sysmex 公司,XE-2100)測定中性粒細胞計數(shù)(NEUT)及中性粒細胞百分比(NEU%)。

1.3.3 N/OFQ、IL-6水平檢測:于入院第2天清晨采集患者空腹非輸液側(cè)肘靜脈血 4 ml,于含有STTⅡ分離膠促凝劑的靜脈真空采血管中分離血清并儲存在-70℃冰箱中待測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清N/OFQ及IL-6濃度(人N/OFQ ELISA試劑盒購自太原市云啟科貿(mào)有限公司,96T-JL19427;人IL-6 ELISA試劑盒購自太原市云啟科貿(mào)有限公司,96T-JL14113),嚴格按照 ELISA 試劑盒操作步驟,依次通過包被、加樣、加酶標抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)和檢測吸光度(A)值完成標本檢測。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 與正常白蛋白尿組相比,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組合并糖尿病視網(wǎng)膜病變比例、糖尿病病程逐漸升高(P<0.05),3組患者的年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、吸煙及飲酒史、相關(guān)合并癥比例(高血壓、冠心病、腦血管病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病足)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較 n=60

2.2 生化指標比較 與正常白蛋白尿組相比,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組HbA1c、mALB、ACR逐漸升高(P<0.05)、eGFR逐漸降低(P<0.05);與微量白蛋白尿組相比,大量白蛋白尿組FBG、NEU%升高(P<0.05);3組患者的CHO、TG、HDL-C、LDL-C、NEUT等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組生化指標比較 n=60,

2.3 N/OFQ、IL-6濃度比較 與正常白蛋白尿組相比較,微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組N/OFQ、IL-6逐漸升高(P<0.05);大量白蛋白尿組N/OFQ、IL-6水平高于微量白蛋白尿組(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清N/OFQ、IL-6濃度比較 n=60,ng/L,

2.4 DKD患者血清N/OFQ、IL-6濃度與臨床各指標的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,糖尿病病程、FBG、HbA1c、mALB、ACR與血清N/OFQ、IL-6均呈正相關(guān)(P<0.05),eGFR與血清N/OFQ、IL-6均呈負相關(guān)(P<0.05),NEU%與血清N/OFQ呈正相關(guān)(P<0.05)，而與IL-6無相關(guān)性(P=0.257);血清N/

OFQ與IL-6水平呈正相關(guān)(P<0.001);血清N/OFQ、IL-6水平與年齡、性別、BMI、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、mALB、NEUT無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 DKD患者血清N/OFQ、IL-6與臨床各指標的相關(guān)性分析

2.5 T2DM患者并發(fā)DKD影響因素分析 以T2DM患者是否合并DKD作為因變量(0=否,1=是),將可能影響DKD的因素(年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病病程、FBG、HbA1c、TG、CHO、HDL-C、LDL-C、N/OFQ、IL-6)作為自變量納入Logistic回歸分析,其中分類數(shù)據(jù)賦值如下:糖尿病視網(wǎng)膜病變、吸煙、飲酒均為0=無,1=有;性別為0=女,1=男。結(jié)果顯示,合并糖尿病視網(wǎng)膜病變,糖尿病病程、HbA1c、LDL-C、N/OFQ、IL-6水平升高是T2DM并發(fā)DKD的獨立危險因素(P<0.05);其余因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 DKD影響因素的logistic回歸分析

2.6 N/OFQ、IL-6單項及二者聯(lián)合檢測對DKD的預(yù)測價值 以微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組為陽性樣本,以正常白蛋白尿組為陰性樣本,建立ROC診斷分析模型。結(jié)果顯示,N/OFQ預(yù)測DKD的ROC曲線下面積(AUC)為0.836(95%CI 0.764～0.909,P<0.001)。IL-6預(yù)測DKD的AUC為0.882(95%CI 0.826～0.938,P<0.001)。N/OFQ、IL-6二者聯(lián)合預(yù)測DKD的AUC為0.924(95%CI 0.887～0.961,P<0.001)。見圖1,表6。

圖1 N/OFQ、IL-6及二者聯(lián)合預(yù)測DKD發(fā)生的ROC曲線

表6 N/OFQ、IL-6單項及聯(lián)合檢測對DKD的預(yù)測價值

3 討論

DKD發(fā)病機制復(fù)雜,雖然高血糖、氧化應(yīng)激和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活是糖尿病相關(guān)腎損害的驅(qū)動力,但大量證據(jù)指出炎性在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[15]。炎癥介質(zhì)升高后通過降低腎臟血流量和濾過率以及改變毛細血管壁的屏障功能導(dǎo)致糖尿病患者的腎損傷,一些針對特定炎癥介質(zhì)(細胞粘附分子、趨化因子和細胞因子)和細胞內(nèi)信號通路的抗炎策略在實驗性DKD模型中顯示出有利的效果,減少了蛋白尿和腎臟損害[16]。因此,深入研究DKD炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或其關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,對從炎癥角度早期識別、干預(yù)DKD進展具有重要意義。

有研究表明,腎臟的炎癥標志物與蛋白尿、細胞外基質(zhì)沉積以及腎小球濾過率進行性下降相關(guān)[17]。DKD早期,白細胞釋放不同的促炎和促纖維化細胞因子,從而引發(fā)炎性和不可逆轉(zhuǎn)的纖維化過程[18]。近年來在研究DKD炎性因子中,IL-6的重要性為大家所關(guān)注:IL-6 mRNA廣泛存在于腎臟間質(zhì)及小管細胞中[19];IL-6水平在慢性腎病患者中顯著升高,并與白蛋白排泄和腎臟肥大相關(guān)[20,21]。本研究結(jié)果顯示,大量白蛋白尿組IL-6濃度明顯高于微量白蛋白尿組及正常白蛋白尿組,相關(guān)性分析結(jié)果中IL-6的水平與FBG、HbA1c、ACR、mALB呈正相關(guān)(r=0.213、0.260、0.562、0.548,P<0.05),與eGFR呈負相關(guān)(r=-0.509,P<0.05),本研究結(jié)果表明在其他因素不變的情況下,IL-6每增加1 ng/L,T2DM患者并發(fā)DKD的危險性增加55.0%,以上提示血清IL-6濃度與DKD病情的嚴重程度相關(guān),這與既往研究結(jié)果[22]一致。故推測其機制可能是IL-6 可促進胰島細胞分泌胰島素,而過量的IL-6會損傷胰島細胞進而使得血糖升高[23]。此外,IL-6介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的損傷:IL-6 結(jié)合于相應(yīng)的IL-6受體,通過JAK/STAT、NF-κB信號通路誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)沉積和肌成纖維細胞的分化或增殖,以上可能促進腎小球基底膜增厚、足突消失和腎小管死亡,導(dǎo)致糖尿病患者腎臟不可逆的功能和結(jié)構(gòu)改變,從而表現(xiàn)為尿微量白蛋白不同程度的增加[24]。由以上可以推斷,DKD患者腎組織表達高水平的IL-6可能參與了DKD發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程,IL-6水平可作為臨床觀察DKD病情的一項參考指標。

N/OFQ是一種新發(fā)現(xiàn)的與經(jīng)典阿片肽具有序列同源性的神經(jīng)肽,作用于非經(jīng)典的阿片受體,N/OFQ及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及外周器官中廣泛表達[25]。近年來N/OFQ在免疫功能方面的作用受到特別關(guān)注,已被描述為免疫調(diào)節(jié)分子的重要來源:N/OFQ誘導(dǎo)免疫細胞趨化性、調(diào)節(jié)細胞因子和其他炎性介質(zhì)的表達以及控制細胞和體液免疫的能力;N/OFQ以濃度依賴的方式誘NF-κB核轉(zhuǎn)位、與DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄[26]。既往研究表明,高血糖通過激活NF-κB通路誘導(dǎo)炎性細胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等的表達[19,27], 而IL-6等促炎細胞因子也可以通過NF-κB通路誘導(dǎo)N/OFQ的轉(zhuǎn)錄增加,從而形呈正反饋通路[28]。在體外和體內(nèi)研究的基礎(chǔ)上,N/OFQ增加了健康麻醉動物和有膿毒性或炎性過程的動物的炎性反應(yīng)[29],它影響組織灌注,增加毛細血管滲漏和炎性標記物,并導(dǎo)致免疫細胞趨化性。進一步研究中指出N/OFQ具有直接募集多形核白細胞的能力[30]。本研究中DKD患者NEU%雖控制在正常范圍內(nèi),但明顯高于T2DM患者,相關(guān)性分析結(jié)果中N/OFQ與NEU%呈正相關(guān)(r=0.166,P<0.05)。白細胞通過兩種不同的機制促進腎損害:(1)腎小球和腎小管細胞的直接相互作用和激活;(2)釋放激活間質(zhì)腎細胞的趨化因子、細胞因子和促纖維化因子。此外,這些間質(zhì)腎細胞分泌額外的趨化因子,促進白細胞的進一步浸潤[31]。所有這些事件在正反饋回路中放大了炎性反應(yīng),從而增強了糖尿病患者的腎臟損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組血清N/OFQ水平明顯高于正常白蛋白尿組,大量白蛋白尿組血清N/OFQ水平又明顯高于微量白蛋白尿組,即隨著DKD病情的進展,N/OFQ濃度也在升高;相關(guān)性分析結(jié)果顯示,mALB、ACR與N/OFQ、IL-6均呈正相關(guān),eGFR與N/OFQ、IL-6均呈負相關(guān),且N/OFQ與IL-6之間呈正相關(guān);Logistic回歸分析結(jié)果顯示,血清N/OFQ、IL-6水平升高是T2DM患者合并DKD的獨立危險因素,提示IL-6和N/OFQ與DKD密切相關(guān),并且在DKD的發(fā)生發(fā)展中可能起著協(xié)同作用。本研究結(jié)果還表明在其他因素不變的情況下,N/OFQ每增加1 ng/L,T2DM患者并發(fā)DKD的危險性增加56.6%。結(jié)合上述研究推測DKD患者血清 N/OFQ 升高的機制可能與持續(xù)的高血糖激活NF-κB通路導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎性因子釋放增加進而導(dǎo)致N/OFQ轉(zhuǎn)錄增加有關(guān),N/OFQ可能通過IL-6介導(dǎo)的炎性機制直接或間接參與腎臟血管內(nèi)膜的損害,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷、血管通透性增加、細胞外基質(zhì)纖維化等病理生理過程。最后,本研究中N/OFQ、IL-6單項及聯(lián)合檢測對DKD預(yù)測價值結(jié)果顯示,檢測N/OFQ、IL-6均可作為DKD的預(yù)測因子(AUC=0.836、0.882),二者聯(lián)合預(yù)測DKD明顯高于單項檢測(AUC=0.924,P<0.001),提示聯(lián)合檢測血清N/OFQ、IL-6對DKD的預(yù)測價值更高,二者可作為觀察DKD病情進展的參考指標。

糖尿病病程的長短與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)[32]。一項對T2DM患者并發(fā)DKD的回顧性研究證實,糖尿病病程是DKD發(fā)生風(fēng)險的獨立預(yù)測因素[33]。糖尿病患者由于長期的糖代謝紊亂,血管內(nèi)皮細胞功能受損,進而使得腎臟組織極易發(fā)生微血管病變[34]。本研究結(jié)果中糖尿病病程是T2DM患者并發(fā)DKD的獨立危險因素,在其他因素不變的情況下,糖尿病病程每增加1年,T2DM患者發(fā)生DKD的危險性增加56.8%。考慮為隨著患者患病時間的增加,患者的微血管病變逐漸加重,導(dǎo)致其不同程度的腎功能損傷,引起患者尿微量白蛋白的增加,這與Ahmad等[35]研究的情況相符。由此可見,T2DM患者應(yīng)每年至少進行1次mALB或ACR的篩查,有利于早發(fā)現(xiàn)是否并發(fā)腎臟損傷。

糖尿病視網(wǎng)膜病變也是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,被NKF/KDOQI指南作為DKD的診斷依據(jù)之一[36]。糖尿病視網(wǎng)膜病變與DKD有共同的發(fā)病機制:AGEs、ROS、蛋白激酶C、炎性因子等,導(dǎo)致血管視網(wǎng)膜組織屏障和進行性腎功能障礙的破壞[37],使得兩者的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)聯(lián)性。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生常早于DKD,大部分DKD患者患有糖尿病視網(wǎng)膜病變[38]。本研究針對糖尿病視網(wǎng)膜病變對T2DM患者腎臟損傷的影響進行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn),合并糖尿病視網(wǎng)膜病變是T2DM患者腎臟損傷的獨立危險因素,即在其他因素不變的情況下,合并糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者比未合并糖尿病視網(wǎng)膜病變患者出現(xiàn)腎臟損傷的風(fēng)險高12.2%,這與其他研究結(jié)果[39]一致。對T2DM患者定期進行眼底檢查,有利于幫助其早期診斷DKD。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,DKD患者血清中N/OFQ、IL-6含量明顯升高且存在相關(guān)性,N/OFQ、IL-6是2型糖尿病患者并發(fā)DKD的危險因素,通過檢測2型糖尿病患者血清N/OFQ、IL-6的水平可為DKD的早期篩查和臨床干預(yù)提供新思路。