醛糖還原酶和晚期糖化終產物受體對糖尿病視網膜病變神經細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的影響

王雅清 李紅敏 張茜玉 王莉 王勇 劉永勝 龐英杰

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見和最嚴重的并發癥之一,是老年人視力受損的主要原因[1]。有證據表明,抑制神經細胞凋亡可能是預防DR病理變化的一種治療策略[2]。體內細胞存活平衡取決于細胞蛋白質和細胞器的合成和降解。如果自噬失敗,這可能導致有害的受損細胞器和蛋白質聚集體的積累[3]。自噬受一系列壓力和刺激的調節,如內質網和高爾基應激、缺氧、細胞毒性和感染。根據刺激,細胞通過特定元素的自噬降解或與其他途徑的相互作用來實現多種功能,從而導致細胞凋亡[4]。因此,細胞死亡和存活取決于自噬控制。自噬途徑在防止衰老和某些癌癥、感染、神經退行性疾病以及代謝、炎癥和肌肉疾病方面起著關鍵作用[5]。高血糖是神經退行性疾病發展的關鍵因素,醛糖還原酶(aldose reductase,AR)表達水平升高與DR發病機制有關[6]。此外,由于AR在高血糖患者葡萄糖代謝中的活性增強,活性氧和山梨糖醇的產生增加,表明AR在神經退行性疾病的進展中發揮了作用[7]。晚期糖化終產物受體(advanced glycation end product receptor,RAGE)免疫球蛋白家族跨膜蛋白是細胞外糖基化終產物AGE 以及其他類別的蛋白質和分子的主要受體[8]。RAGE的最佳特征配體是CML蛋白加合物,其在高血糖和其他壓力條件下升高。RAGE是第一個發現的也是迄今為止研究最多的 AGE受體[9]。臨床證據表明,高RAGE水平可能會促使視網膜毛細血管的增殖變化,使其發生更嚴重的DR[10]。本研究在1型鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中探討AR和RAGE對DR神經細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗小鼠:使用C57BL/6J 小鼠(Jackson Laboratories,Sacramento,CA,USA)購自河北省實驗動物中心,合格證號:SCXK(冀)2022-001。將其飼養在 12 h光照/黑暗循環中,光照水平<60勒克斯。飼養期間小鼠可隨意獲取食物和水。動物研究符合 ARVO 關于在眼科和視覺研究中使用動物的聲明。該研究方案得到了當地動物研究倫理委員會的批準。

1.1.2 糖尿病小鼠模型:通過連續5 d腹膜內注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg BW),在2個月大的禁食雄性小鼠中誘發胰島素缺乏型糖尿病。根據需要給予胰島素以維持 BW并允許 BW 緩慢增加,同時允許高血糖、多尿和食欲亢進(每2～3天0～0.2 U)。每 2～3個月通過測量總糖化血紅蛋白水平和測量血糖濃度。血糖值超過 300 mg/dl 的小鼠被認為患有糖尿病。

1.1.3 實驗分組:對照組(標準條件飼養的小鼠,注射0.9%的氯化鈉溶液作為對照,n=15),模型組(如前所述,通過腹腔注射鏈脲佐菌素誘導小鼠發生糖尿病,n=15),觀察組(糖尿病小鼠誘導成功后,飲食中加入依帕司他原藥按50 mg/kg,FPS-ZM 5 mg/d喂養,依帕司他和FPS-ZM分別為AR和RAGE的抑制劑,用藥持續1周,n=15)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質印跡分析:從安樂死的小鼠中快速解剖視網膜組織并在含有蛋白酶抑制劑(Beyotime)和磷酸酶抑制劑的 RIPA 緩沖液(Beyotime,上海,中國)中裂解。裂解液于 4℃ 12 000 r/min 離心 10 min,收集上清液。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(20 μg)并印跡到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,USA)上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,膜與以下一抗4℃孵育過夜:RAGE、AR。在 Tris 緩沖鹽水和 Tween-20(TBST)中洗滌后,將免疫印跡與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶10 000,Cell Signaling Technology)在室溫下孵育 1 h,使用化學發光試劑使用化學發光試劑顯色印跡。增強化學發光(ECL)試劑盒(Millipore)。

1.2.2 RT-PCR:為了分析 mRNA 表達,從小鼠視網膜組織中提取總RNA,定量并使用 1μg 總 RNA 合成第一鏈 cDNA。使用 StepOnePlusTM實時 PCR 系統進行實時(RT)-PCR。PCR 擴增使用 SYBR Green PCR Master Mix 進行三次重復。使用以下循環優化每個基因的反應條件:初始循環設置為 95°C 7min;在 95°C15秒和 60°C 1min下進行 30 個循環;在 95°C1min、55°C30秒和 95°C30秒下進行1個循環以獲得解離曲線。不含模板 cDNA 的反應混合物用作陰性對照。使用GAPDH的 Ct 值作為內源對照,通過比較 Ct 方法(ΔΔCT)確定基因表達水平。

1.2.3 視網膜電圖(ERG):在患糖尿病后,對各實驗組小鼠進行暗視和明視 ERG 測試。對于暗視 ERG 記錄,向小鼠呈現強度增加的單次閃光(2.19 × 10-4至 83.7 cd·s-1·m-2,0.6 log 單位步長),每次重復5次,刺激間隔為 20 s最亮的閃光為 1 min。平均每個閃光亮度下的5個 ERG 軌跡。從背景開始≥15 min后,通過將測試閃光(0.016～377 cd·s-1·m-2)疊加在桿飽和強度(30 cd/m2)的穩定背景上,獲得孤立的錐體成分。

1.2.4 視網膜組織中的免疫熒光:將眼球摘除并用 4% 多聚甲醛固定,在磷酸鹽緩沖液中的 30% 蔗糖中冷凍保護,在包埋培養基中冷凍。10 μm 視網膜切片用 BSA 封閉,并與抗Caspase-8和抗Caspase-3 一起孵育,在 4℃下過夜,與適當的二抗一起孵育。通過省略一抗建立陰性對照。將切片與適當的二抗一起孵育。將切片沖洗并用含有用于細胞核染色的 4’,6’-二氨基-2-苯基吲哚的抗褪色培養基蓋玻片。在熒光顯微鏡下檢查載玻片,使用合適的熒光素異硫氰酸酯 1 和羅丹明發射濾光片。來自每只動物的3個非連續視網膜切片(相距 100 μm)和每組4只動物的3張圖像被納入分析。

1.2.5 TUNEL 檢測:通過TUNEL測定檢查細胞凋亡計數視網膜的 TUNEL 陽性細胞核 GCL。簡而言之,在室溫下用冰-丙酮溶液固定 8 min后,將冷凍保存的組織切片與 1 ml 封閉緩沖液(PBS 中的 3% 正常山羊血清)一起孵育 1 h。孵育后,將切片置于透化溶液(0.1% Triton X-100 的 0.1% 檸檬酸鈉溶液)中冰上 2 min。將切片在 50 μl TUNEL 反應混合物(Roche Diagnostics GmbH,德國)中孵育,并在 37℃下在黑暗中孵育 60 min。在反應后用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對切片進行復染。在熒光顯微鏡(Olympus,Japan)下觀察切片。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗:使用相應的小鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β DuoSet ELISA 開發試劑盒(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)和小鼠 VEGF DuoSet 試劑盒(R&D Systems,Inc.)測定培養基中分泌的 TNF-α TNF-α、IL-6、IL-1β和 VEGF。使用 BioTek SynergyTM4 Hybrid Microplate Reader 檢測光密度,并通過平行生成的標準曲線外推的吸光度值推導出細胞因子水平。

2 結果

2.1 蛋白印跡分析AR和RAGE表達 模型組較對照組AR和RAGE的蛋白表達升高(P<0.05),觀察組較模型組AR和RAGE的蛋白表達降低(P<0.05),表明AR和RAGE促進了DR的發生,而藥物阻斷成功抑制體內AR和RAGE的表達水平。見圖1,表1。

表1 蛋白印跡分析AR和RAGE表達

圖1 蛋白印跡分析AR和RAGE

2.2 AR和RAGE誘導自噬機制的啟動 通過PCR分析大鼠視網膜裂解組織中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3 II/I 和 p62/SQTSM1的mRNA表達,模型組較對照組Beclin-1、LC3 II/I 和 p62/SQTSM1的mRNA表達升高(P<0.05),觀察組較模型組表達降低(P<0.05),實驗數據表明AR和RAGE參與了自噬通量功能障礙的形成。見表2。

表2 PCR分析自噬蛋白的轉錄

2.3 AR和RAGE參與DR的發生 模型組較對照組暗視b波和暗視a波的振幅降低(P<0.05),觀察組較模型組升高(P<0.05),實驗數據表明當AR和RAGE表達受阻降低了鏈脲佐菌素誘導的小鼠DR。見表3。

表3 ERG分析小鼠的視網膜受損程度 μV,

2.4 AR和RAGE加劇神經細胞凋亡 通過免疫熒光分析大鼠視網膜組織中Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達,模型組較對照組Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達升高(P<0.05),觀察組較模型組的蛋白表達降低(P<0.05),表明當降低AR和RAGE的表達,caspase 8、Caspase-3的活性和細胞凋亡就會得到改善,從而保護細胞免于死亡。TUNEL分析了小鼠視網膜神經細胞的凋亡,與對照組相比,鏈脲佐菌素誘導的DR神經細胞凋亡量增加(P<0.05),當AR和RAGE受到抑制后,陽性細胞數量降低(P<0.05)。見圖2,表4。

表4 免疫熒光分析Caspase-8和Caspase-3表達

觀察組 模型組 觀察組

2.5 ELISA試劑盒測定分泌的炎性因子和VEGF水平 通過ELISA分析血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF的分泌水平,模型組較對照組TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF的水平升高(P<0.05),觀察組較模型組降低(P<0.05)。見表5。

表5 ELISA分析TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF水平 pg/ml,

2.6 PCR分析高爾基應激反應相關因子的表達 模型組較對照組DR4、TRAPPC13、MAPK和ETS的mRNA表達升高(P<0.05),觀察組較模型組表達降低,差異有統計學意義(P<0.05),數據表明抑制AR和RAGE表達可以降低小鼠DR神經細胞的高爾基應激反應。見表6。

表6 PCR分析高爾基應激反應相關因子的表達 pg/ml,

3 討論

DR被認為是一種微血管并發癥。最近的研究指出,神經變性發生在血管病變發生之前,并有助于DR的發生和進展[11]。AR是多元醇途徑的第一個限速酶和醛酮還原酶超家族的成員,負責 NADPH 依賴性葡萄糖還原為山梨糖醇[12]。一般來說,葡萄糖主要通過糖酵解途徑代謝,因此多元醇途徑對葡萄糖代謝的影響很小,不被認為對非糖尿病患者構成威脅。然而,在高血糖時,多元醇途徑和AR刺激后有很大的增加[13]。依賴RAGE和AR的信號傳導是高血糖積累的致病原因,并且其本身對于正常發育和衰老在很大程度上是可有可無的。因此,RAGE 途徑的抑制構成了治療與AGE積累相關的疾病的有吸引力的目標。在生理上,幾種RAGE抑制劑是通過選擇性剪接產生的,以產生沒有細胞內結構域的RAGE分子[14]。已經產生了幾種RAGE抑制劑藥物,其中一些已進入臨床研究,包括 PF-04494700,目前正處于治療阿爾茨海默病患者癡呆癥的3期試驗中。PF-04494700 通過阻止許多配體與 RAGE結合而在細胞外發揮作用,并且能夠穿過血腦屏障[15]。另一種細胞外作用的RAGE抑制劑 FPS-ZM1 能夠阻斷由 Aβ42 和 BSA-AGE 介導的RAGE信號傳導。其他靶向RAGE細胞內結構域的藥物正在開發過程中,該結構域與RAGE依賴性信號調節劑 DIAPH1 相互作用,盡管這些研究仍處于臨床前階段。

自噬是在正常和壓力條件下調節細胞穩態的重要過程。多項研究表明,自噬的作用會隨著時間和損傷程度而變化,自噬早期可能通過抑制細胞凋亡而具有保護作用,而晚期或過度自噬會加重細胞損傷[16]。一項研究發現適當的自噬的誘導可能對果蠅和帕金森病小鼠產生神經保護作用[17]。我們的初步研究表明,暴露于高糖條件下的視網膜神經細胞的自噬水平升高,自噬的激活可能表現出細胞保護作用。多項研究表明,自噬功能障礙是DR發病機制中存在的早期事件[18]。在本研究中,我們發現在糖尿病小鼠模型中,自噬相關蛋白 LC3-II 和 Beclin-1 的表達升高,而降低RAGE和AR的表達處理有效地抑制自噬和自噬相關蛋白的表達。盡管自噬在DR發病機制中的作用仍不確定,但現有的幾項研究表明,抑制高糖誘導的細胞和神經元的自噬,同時激活自噬可產生保護作用。基于此,我們推測 DR中視網膜自噬的恢復可能會發揮保護作用。

這項研究檢查了由于鏈脲佐菌素誘導的糖尿病在小鼠視網膜中發生的電生理、和生化變化。除了已知的細胞凋亡過程外,自噬途徑可能與神經元視網膜變性有關。總體而言,我們的結果表明,視網膜神經特別容易受到糖尿病的影響,這可能是由于它們的高代謝需求。我們的結果顯示暗視a波和b波減少,這與其他作者先前報道的糖尿病小鼠模型數據一致。在體內研究中,糖尿病小鼠表現出Beclin-1和p62/SQTSM1的明顯增加,并伴有視網膜組織中溶酶體功能的損害。這表明溶酶體損傷和自噬功能障礙是DR發病機制中存在的早期事件。正如其他小組先前所描述的那樣,視網膜繆勒氏細胞會對各種損傷做出反應,包括向視網膜組織大量釋放 VEGF。這種后來的現象可能導致血視網膜屏障的破壞,最初導致視網膜水腫,導致視網膜新生血管形成[19]。蛋白質 p62/SQTSM1 是一種功能性蛋白質,它在細胞的命運中起到關鍵作用。在本研究中,我們發現Caspase-8和Caspase-3參與高血糖條件下誘導的視網膜神經細胞的凋亡。p62/SQTSM1 和Caspase-8和Caspase-3途徑之間的相互作用表明 p62/SQTSM1 決定了糖尿病條件下的神經細胞的死亡。我們的研究結果表明,在高糖條件下,自噬機制被觸發,但自噬通量受到損害。由于其溶酶體儲存性質,自噬底物(p62/SQTSM1)在細胞質中積累,發出細胞凋亡和大量 VEGF 產生的信號。當RAGE和AR降低表達恢復溶酶體活性,改善自噬并減輕視網膜細胞凋亡和VEGF產生。VEGF誘導的新血管形成是DR的另一個主要原因,其涉及不穩定的視網膜毛細血管的異常增殖。血漿內容物毛細血管滲漏到視網膜會導致視網膜水腫和視力障礙。研究表明,RAGE和AR抑制是減少DR中視網膜炎癥和 VEGF 分泌的有吸引力的治療靶點。TNF-α是DR中最主要的促炎細胞因子之一,參與白細胞活化和細胞凋亡,主要由活化的內皮細胞和炎癥細胞產生。與我們的研究結果表明,先前的研究表明,糖尿病視網膜中TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達增加,并有助于 DR 的進展。表明RAGE和AR抑制能抑制炎癥介質的釋放和減少細胞凋亡因子的表達來改善視網膜損傷。

類似于內質網應激,高爾基體應激也可以誘導細胞死亡。ARF4 是一種小 G 蛋白,調節來自高爾基體的囊泡運輸。使用布雷菲爾德菌素A處理后,ARF4 mRNA 水平增加,表明 ARF4 是CREB3 途徑的靶基因。CREB3 通路的其他靶基因包括DR4和TRAPPC13[20]。DR4 編碼一種死亡受體,調節高爾基體應激誘導的細胞死亡,而TRAPPC13是TRAPPIII 復合物的組分,在某些應激條件下調節自噬通量。他們將 CREB3 鑒定為定位于內質網膜的傳感器轉錄因子,它屬于 ATF6 蛋白家族。ATF6 是眾所周知的傳感器轉錄因子,調節內質網應激反應的 ATF6 通路,其中靶基因包括內質網伴侶。在沒有高爾基體應激的情況下,CREB3 保留在ER膜中,而CREB3 在高爾基體應激時被轉運到高爾基體并被蛋白酶S1P和S2P裂解,導致 CREB3 的胞質區域從高爾基體膜及其易位到細胞核。除了 CREB3 通路之外, MAPK-ETS 通路也誘導細胞死亡以應對高爾基體應激,通過檢查在高爾基體脅迫誘導劑處理后轉錄增加的靶基因的啟動子區域,并通過轉錄因子結合基序富集分析尋找可以與啟動子結合的轉錄因子,從而得到 鑒定來自 ETS 家族的三種轉錄因子(ELK1、ETS1 和 GABPA/B)。該項研究還發現MEK1/2 和ERK1/2 等MAPK被 BFA、Golgicide A 和莫能菌素處理激活,并提出高爾基體應激通過激活 MAPK 級聯反應激活 ETS轉錄因子,導致細胞死亡。[20]

綜上所述,我們研究表明,AR表達水平與DR發病機制相關,RAGE的最佳特征配體是CML蛋白加合物,其在高血糖和其他壓力條件下升高。1型鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中AR和RAGE對DR神經細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平有影響。抑制RAGE和AR可預防鏈脲佐菌素誘導的小鼠的DR,降低RAGE和AR體內的表達可顯著改善小鼠的視力情況,并且可以抑制視網膜病變神經細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的發生。