下調miR-210對精索靜脈曲張大鼠干預效果及作用機制研究

方茂霖 李兆萍 王蘊琪 楊文濤 周磊 李群生

精索靜脈曲張是造成男性不育癥的主要原因,以左側發病為主,精索靜脈曲張可使睪丸灌注減少,進而導致了睪丸體積下降、精液質量異常、睪丸生精功能異常的發生,最終對患者的生育功能造成了影響[1-3]。精索靜脈曲張的主要病理表現為間質性水腫、睪丸組織內生精細胞脫落、微血管病變等,微小RNA-210(miR-210)是一種在缺氧相關疾病、腫瘤細胞、正常細胞中表達存在顯著差異的缺氧因子之一,miR-210對微血管的形成具有促進作用,進而促進了精索靜脈曲張患者病情的發展[4]。基于上述背景,本文研究中分析了下調miR-210對精索靜脈曲張大鼠干預效果及作用機制,以期望為后續臨床及實驗研究提供理論依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取44只SPF級Wistar雄性大鼠,體重150～200 g,由中科中山藥物創新研究院提供,動物許可證號:SYXK(粵)2020-0239,本次試驗操作參照動物試驗倫理要求的相關規定,且經我院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模:選取44只大鼠,12只作為假手術組,其余32只參照劉建國等[5]的方法建立精索靜脈曲張模型作為精索靜脈曲張模型組,對左腎靜脈、左腎總靜脈之間交通支進行部分結扎,假手術組只進行左腎靜脈分離,不結扎,所有大鼠在術后給予肌內注射青霉素鈉預防感染,劑量為20萬U/d,共注射3 d,喂食標準飼料,喂養48周后,每組取2只進行剖腹觀察,通過游標卡尺對大鼠左側精索靜脈直徑進行測量,觀察其曲張程度,大鼠左側精索內靜脈直徑比與假手術組擴張2倍,雙腎大小無明顯差異,左腎無缺血萎縮等明顯病變即為建模成功。建模成功后將精索靜脈曲張模型組剩余30只大鼠分為模型組、上調組、下調組,每組10只。

1.2.2 miR-210轉染:將所購買的miR-210模擬物(miR-210 mimic,上調)、miR-210抑制物(miR-210 inhibitor,下調)利用Lippofectamine 2000試劑盒稀釋為5 mmol/L,將稀釋后的miR-210模擬物、miR-210抑制物分別注射于上調組、下調組大鼠胃組織中,假手術組、模型組注射同劑量的蒸餾水灌胃,注射24 h后觀察大鼠變化。

1.3 觀察指標

1.3.1 病理學形態學觀察:于miR-210轉染后,每組取2只大鼠麻醉后處死,獲取大鼠附睪組織,經脫水、石蠟包埋處理后,做HE染色,光鏡下觀察病理形態改變。

1.3.2 miR-210轉染效率鑒定:于miR-210轉染后,每組取2只大鼠麻醉后處死, miR-210轉染效率經通過實時熒光定量法進行鑒定,提取造膜側睪丸組織總RNA,使用Takara逆轉錄試劑盒將組織中的RNA逆轉錄為cDNA,采用Primer 5.0軟件設計引物序列,啟動PCR儀,反應體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYBGreen,加蒸餾水至20 μl。反應條件:97℃預熱8 min、95℃變性5 s、60℃退火31 s,共進行40個循環,采用2-ΔΔCt方法計算出 miR-210的表達量。miR-210上游引物序列:5’-CTGGAGCTGTGCGTGTGACAGC-3’,下游引物序列:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;內參GAPDH上游引物序列:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’,下游引物序列:5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’。

1.3.3 精液質量檢測:按照WHO《人類精液及精子-宮頸黏液互相作用實驗室檢驗手冊(第四版)》標準對精子質量進行檢測[6]。于miR-210轉染后,斷頸處死4組大鼠,迅速取左側附睪,剪碎,溶于8 ml 0.9氯化鈉溶液,37℃繼續孵育15 min直至精子完全游出,獲得精子懸液,滴到精子計數板上對4組大鼠精子濃度、精子活率進行檢測。

1.3.4 氧化應激指標水平檢測:于miR-210轉染后,取大鼠睪丸組織越1 mm3,加入適量(1∶10)組織蛋白抽離液,充分碾碎,在半徑3 cm,轉速3 000 r/min的條件下離心15 min,提取上清液,0℃保存待測,采用黃嘌呤氧化酶法對4組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)水平進行檢測,通過TBA法對4組大鼠丙二醛(MDA)水平進行檢測。

1.3.5 Nrf2/HO-1信號通路相對表達量檢測:通過Western Blot方法對睪丸組織中的Nrf2/HO-1信號通路蛋白核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)相對表達量進行檢測,將4組大鼠睪丸組織剪碎后加入裂解液,進行30 min裂解,以離心半徑3 cm,轉速3 000 r/min離心處理10 min,取上清液,做BCA(bicinchoninic acid)蛋白定性檢測,將樣品上樣至8% SDS-PAGE凝膠上,經電泳后轉移至PVDF膜上,用PBS封閉2 h后,加入TBST稀釋的羊抗鼠 Nrf2、HO-1(1∶2 500)一抗,后4℃條件下孵育過夜,洗膜3次,加入1∶10 000的稀釋羊抗鼠二抗,溫室孵育1 h,做TBST洗膜3次,以β-actin為內參照,定量分析蛋白表達情況,重復試驗3次。鼠源性一抗由上海嶸崴達實業有限公司提供。

2 結果

2.1 精索靜脈曲張模型建模成功的判定 光鏡下觀察,假手術組大鼠生精小管內生精上皮層數完整,小管形態飽滿,生精細胞排列有序,精索靜脈曲張模型組大鼠的生精小管內生精上皮明顯變薄,并且大量生精細胞缺失。見圖1。

圖1 光鏡下病理切片對照(HE染色×200)

2.2 病理特征比較 光鏡下,假手術組大鼠各生精小管排列有序、結構正常,各級細胞層次整齊光鏡下,且清晰,未觀測到明顯形態異常,模型組生精小管內各級生精細胞層次較為紊亂,管腔內有少量精子存在,并且部分細胞結構不同程度受損;上調組大鼠的生精小管管腔縮窄,腔內少見正常精子,生精小管內各級生精細胞大量缺失,且脫落現象嚴重;下調組生精小管腔壁有明顯擴大,一部分生精小管恢復正常管腔內可見多數正常精子。見圖2。

圖2 病理特征比較(HE染色×200)

2.3 miR-210轉染效率鑒定 與假手術組相比,模型組、上調組、下調組miR-210表達量上升,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,下調組miR-210表達量下降,上調組miR-210表達量上升,差異有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組miR-210表達量下降,說明轉染成功。見表1。

表1 miR-210轉染效率鑒定 n=10,

2.4 4組大鼠精液質量比較 與假手術組相比,模型組、上調組、下調組精子濃度、精子活率水平下降,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,上調組精子濃度、精子活率水平下降,下調組精子濃度、精子活率水平上升,差異有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組組精子濃度、精子活率水平上升,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠精液質量比較 n=10,

2.5 4組大鼠氧化應激指標水平比較 與假手術組相比,模型組、上調組、下調組SOD水平下降,MDA水平上升,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,上調組SOD水平下降,MDA水平上升,下調組SOD水平上升,MDA水平下降,差異有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組SOD水平上升,MDA水平下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠氧化應激指標水平比較 n=10,

2.6 4組大鼠睪丸組織Nrf2/HO-1通路蛋白相對表達量 與假手術組相比,模型組、上調組、下調組Nrf2、HO-1相對表達量下降,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,上調組Nrf2、HO-1相對表達量下降,下調組Nrf2、HO-1相對表達量上升,差異有統計學意義(P<0.05);與上調組相比,下調組組Nrf2、HO-1相對表達量上升(P<0.05)。見表4,圖3。

表4 4組大鼠睪丸組織Nrf2/HO-1通路蛋白相對表達量 n=10,

圖3 Nrf2/HO-1通路蛋白WB圖

3 討論

目前臨床最主要通過藥物、腹腔鏡手術、顯微外科手術、開放手術對精索靜脈曲張患者進行治療,藥物雖然可使靜脈回流增加,但整體治療效果不佳,手術治療患者術后可能出現血小板活化、聚集、黏附等現象,進而引發了輕微血栓、管壁炎癥反應的發生,最終導致了精索靜脈曲張復發或不良反應的出現[7,8]。研究顯示,精索靜脈曲張病情的發展與組織缺氧、氧化應激所導致的炎癥、細胞凋亡存在密切聯系,因此改善組組織缺氧及氧化應激反應對精索靜脈曲張的治療具有重要意義[9]。

miR-210在腫瘤形成、缺氧機制中發揮著重要作用,在缺氧時miR-210對DNA損傷、線粒體活動、細胞增殖具有抑制作用,在腫瘤發生機制中,miR-210一方面受HIF-1α的調控,另一方面miR-210可對HIF-1α進行調控,兩者相互調節,進而使得兩者的表達量增加,調節了機體的缺氧環境[10,11]。研究顯示,miR-210、HIF-1α在精索靜脈曲張睪丸組織中表達升高,可能與睪丸附睪損傷有關[12]。本文研究顯示,下調miR-210可干預精索靜脈曲張的病情發展,病理組織觀察顯示,經miR-210下調干預后大鼠生精小管腔壁有明顯擴大,一部分生精小管恢復正常管腔內可見多數正常精子,此結果提示著下調miR-210可改善精索靜脈曲張大鼠精液質量,其機制可能于組織缺氧改善,Nrf2/HO-1信號通路被激活有關。

精子密度、精子活動度是研究雄性生殖健康的重要指標,精子密度是影響生育的重要因素,當精子密度等于0時會造成無精子癥的發生,精子活動度直接決定著精子是否可以正常游走到生殖管道與卵子進行結合,精索靜脈曲張是影響精子發育和精液質量的主要疾病之一,患者精子密度、精子活動度會隨之下降[13,14]。研究顯示,反應活性氧、內源性促氧化因子表達過度可導致氧化應激的發生,同時反應活性氧的過度表達會造成附睪上皮細胞超微結構改變及功能障礙,最終引發了男性不育[15]。SOD可通過對多余反應活性氧的消除,進而起到了保護細胞的作用,阻止了精索靜脈曲張病情的發展[16]。MDA是一種具有細胞獨行的脂質過氧化終產物,可用于細胞質膜損傷程度的評價[17]。本文研究顯示,精索靜脈曲張可導致精子密度、精子活動度、SOD水平下降,MDA水平上升,經下調miR-210干預后上述指標改善,表明下調miR-210可抑制病情發展,改善精液質量。

Nrf2是一種具有抗癌、拮抗細胞凋亡、抗炎、維持細胞氧化還原平衡作用的轉錄因子,Nrf2在正常情況下可與特異性受體Keap1在細胞質中進行結合進而失去自身活性,在氧化應激反應刺激下Nrf2可從Keap1中解離,與抗氧化類反應元見進行結合,進而激活了HO-1等下游基因,最終使細胞的抗氧化能力得到增強[18,19]。HO-1可阻止游離血紅素參與氧化反應,同時HO-1可與其酶解產物相互協作起到了抑制細胞凋亡、改善組織微循環、抗氧化、擴血管、抗炎的作用[20,21]。本文研究顯示,Nrf2/HO-1通路蛋白相對表達量在精索靜脈曲張發生后下降,經miR-210下調干預后,Nrf2/HO-1通路蛋白相對表達量上升,表明miR-210下調可能通過激活Nrf2/HO-1通路來抑制生精細胞凋亡,起到了阻止精索靜脈曲張大鼠附睪組織損傷的作用,為精子的發育、成熟提供了有利條件。

雖然本文認為下調miR-210具有改善精索靜脈曲張的作用,其作用機制可能與Nrf2/HO-1通路被激活相關,但僅為本文研究,未有研究分析其具體作用機制,因此上述研究需后續研究進一步分析驗證。

綜上所述,本文研究顯示,精索靜脈曲張發生后伴隨精子密度、精子活動度水平下降,等表現,經下調miR-210干預后可改善上述情況,其機制可能與Nrf2/HO-1通路被激活有關。