白藜蘆醇對脂多糖誘導的牙周膜細胞凋亡及p38 MAPK/NF-κB信號通路的影響

包慧琦 高雅 王莉

牙周膜細胞結構主要為膠原纖維,也被稱為牙周韌帶,可以固定牙齒,是位于牙根與牙槽骨之間的結締組織,血管豐富,有豐富的感覺神經神經末梢,極為敏感,在牙齒受到咀嚼壓力時,可以緩解壓力,緩沖外來的力量不直接在牙槽骨作用,可以形成牙槽骨、牙骨質,具有破壞后重建功能,牙周組織對于垂直方向作用力有強大的抵抗能力,側方壓力作用較弱,容易受到損傷,牙周膜細胞凋亡則會引起各種不良反應[1-3]。脂多糖是脂質和多糖復合的產物,是革蘭陰性厭氧菌中的一種致病物質,亦是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的主要成分,具有獨特的難滲透性,可以有效幫助細菌細胞抵御外界有害刺激,避免胞膜受到攻擊,具有抗原性,可以穩定整個胞膜的結構,為細菌的結構完整性做出了巨大貢獻,但是脂多糖可以加快蛋白的表達,可以加快炎性細胞因子與其他炎性介質的合成、釋放,引起炎癥反應,加快細胞的凋亡[4,5]。白藜蘆醇是遭受真菌病害感染反應后分泌的一種抗毒素,是一種天然的抗氧化劑,可以在葡萄的葉子和葡萄皮中反應合成,具有抗氧化、抗炎、免疫調節,保護心血管的功能,可以在肝臟內迅速代謝,有益于人類生命健康[6,7]。基于此,本文探究通過調節白藜蘆醇濃度對脂多糖誘導的牙周膜細胞凋亡的調控及對p38 MAPK/NF-κB信號通路的影響,并對其作用機制進行分析,為臨床研究牙周膜細胞凋亡提供了新道路。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞:人牙周膜細胞HPDLF購于上海弘順生物科技有限公司。主要試劑:RPMI-1640培養基試劑盒(艾美捷科技有限公司,貨號:RPP11-10LT);RIPA裂解液(北京普利萊(APPLYGEN)基因技術有限公司,貨號:C1055-100);Heochest 33258染色制劑試劑盒(深圳子科生物科技有限公司,貨號:ZK-L0597);p38 MAPK/NF-κB試劑盒(武漢瓊格生物科技有限公司生產;貨號:EH3422)。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜細胞培養:將牙周膜細胞放入含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、酶聯素100 μg/ml的RPMII-1640培養液中,并將培養液放入溫度為37℃、5%CO2、的培養箱中進行培養,每間隔1 d～2換1次新鮮培養液,細胞貼壁80%～90%時,將培養基除去,進行傳代培養,1周進行3次,選擇生長較的對數生長期細胞進行后期實驗。將上述所制備的細胞分為對照組(不做任何處理的牙周膜細胞)、白藜蘆醇低劑量組(白藜蘆醇30 μmol/L+脂多糖10 μg/ml)組、白藜蘆醇高劑量組(白藜蘆醇90 μmol/L+脂多糖10 μg/ml)組,共3組。

1.2.2 細胞轉染:取對數牙周膜細胞,將其接種于6孔板上,每孔1×105個細胞,放入37℃ 5% CO2飽和濕度的培養箱內,細胞長至30%左右時開始轉染,采用Lipofectamine 2000進行轉染,分為對照組(不做任何處理的牙周膜細胞)、白藜蘆醇低劑量組(白藜蘆醇30 μmol/L+脂多糖10 μg/ml)組、白藜蘆醇高劑量組(白藜蘆醇90 μmol/L+脂多糖10 μg/ml)組。之后將每個孔培養液補充至2 ml,另外對照組置入同體積的培養液,繼續進行篩選培養以得到最優時間后收取每組的細胞。步驟重復試驗5次。

1.2.3 轉染效率驗證:采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法鑒定p38 MAPK/NF-κB轉染效率,在p38 MAPK/NF-κB轉染24 h后取各組細胞,放入含有裂解液的EP管,將其放入4℃離心機,在12 000 r/min下離心處理10 min,棄去上層清液,提取其中RNA,使用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄處理,獲得總cDNA,采用Primer 5.0軟件設計引物序列,啟動PCR儀,反應體系:1 μl cDNA模板、3.4 μl dH2O混合,加蒸餾水至20 μl。反應條件:95℃10 min、95℃ 15 s、60℃ 30 s,共進行40個循環,采用2-ΔΔCt方法計算出p38 MAPK/NF-κB表達量。p38 MAPK引物序列:上游:5’-ACCACGACCCTGATGATGAGC-3’,下游:5’-TAGGTCAGGCTCTTCCATTCGT-3’,NF-κB引物序列:上游:5’-CAGATACCACTAAGACGCACCC-3’,下游:5’-CTCCAGGTCTCGCTTCTTCACA-3’,內參β-actin引物序列:上游:5’-TCATCATCTCTGCCCCCTCT-3’,下游:5’-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’。本試驗重復測量3次。

1.2.4 細胞增殖檢測:采用MTT法檢測細胞增殖情況,將進行穩定傳代的牙周膜細胞消化,將細胞懸液濃度調整為1×104個/L,并接種于96孔板內,在每孔中加入200 μl培養液進行培養,分別與24、48、72 h后向每孔加入200 μl MTT,37℃、5% CO2下孵育4 h后取出,進行1 000 r/min離心處理10 min,將孔中培養液吸去,加入200 μl DMSO,搖晃10 min,測定其OD值,并對增殖率進行計算,細胞增殖率=(檢測的細胞組OD值/對照組OD值)×100%。試驗重復測量3次。

1.2.5 細胞凋亡檢測:采用Heochest 33258法測定細胞凋亡情況,使用5%左右的甲醛穩固25～30 min后除去穩固液體,將所培養的細胞用PBS洗凈后,將細胞置入玻片進行自然性風干,放入容量為490～510 ng/ml的Heochest 33258染色制劑0.4 ml,靜置4 min,室內溫度培養25～30 min后洗凈,等風干,加入DAPI染色封片,將顯微鏡倒放檢測細胞核被染色為藍色后的形態,形態密集重染的屬于凋亡性細胞。細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。實驗重復5次。

1.2.6 細胞p38 MAPK/NF-κB通路蛋白檢測:采用Western Blot 法檢測p38 MAPK、NF-κB通路蛋白表達量,取對數生長期細胞,將培養細胞進行離心處理,后提取上層清液,測定其蛋白含量,放入-80℃冰箱中,使用聚丙烯酰胺進行凝膠電泳,在凝膠孔中加入40 μl樣品蛋白,進行電泳處理,待凝膠電泳后轉膜,取模,在4℃的環境下使用10%脫脂牛奶進行1 h封閉處理,加入之后分別加入1∶1 000 TBST給予稀釋的p38 MAPK、NF-κB一抗,室溫下孵育1 h,并4℃過夜,使用TBST洗膜3次,10 min/次,加入1∶10 000的二抗在室溫下孵育2 h,使用TBST洗膜3次,10 min/次,二氨基聯苯胺顯色,使用Labwork凝膠圖像掃描所獲得膠片,以GAPDH為內參,計算p38 MAPK、NF-κB蛋白表達量。

2 結果

2.1 3組細胞增殖率比較 與對照組相比,白藜蘆醇低劑量組細胞增殖率降低,白藜蘆醇高劑量組細胞增殖率升高,差異有統計學意義(P<0.05);與白藜蘆醇低組相比,白藜蘆醇高劑量組細胞增殖率升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組細胞增殖率比較 %,

2.2 3組細胞凋亡情況比較 與對照組相比,白藜蘆醇低劑量組細胞凋亡率升高,白藜蘆醇高劑量組細胞凋亡率降低,差異有統計學意義(P<0.05);與白藜蘆醇低劑量組相比,白藜蘆醇高劑量組細胞凋亡率降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

A 對照組 B 白藜蘆醇低劑量組 C 白藜蘆醇高劑量組

表2 3組細胞增凋亡情況比較 %,

2.3 3組細胞p38 MAPK/NF-κB信號通路蛋白表達量比較 與對照組相比,白藜蘆醇低劑量組p38 MAPK/NF-κB蛋白表達量升高,白藜蘆醇高劑量組p38 MAPK/NF-κB蛋白表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05);與白藜蘆醇低劑量組相比,白藜蘆醇高劑量組p38 MAPK/NF-κB蛋白表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 p38 MAPK/NF-κB信號通路蛋白WB圖

表3 3組細胞JAK-STAT信號通路蛋白表達量比較

3 討論

牙周膜也被成為牙周韌帶,是由極為緊密的結締組織構成的,位于牙根與牙槽骨之間,主要將牙齒和牙槽骨聯結起起來,可以固定牙齒,結締組織血管豐富,有豐富的感覺神經神經末梢,極為敏感,在牙齒受到咀嚼壓力時,可以緩解壓力,緩沖外來的力量不直接在牙槽骨作用,可以形成牙槽骨、牙骨質,具有破壞后重建功能,牙周膜的淋巴管分布在各個頸部淋巴結當中,當牙周受到膜感染時,一般會造成局部淋巴結腫大的情況。牙周組織對于垂直方向作用力有強大的抵抗能力,側方壓力作用較弱,容易受到損傷,牙周膜細胞凋亡則會引起各種不良反應[8-10]。因此本文通過研究白藜蘆醇含量對脂多糖誘導的牙周膜細胞凋亡以及對p38 MAPK/NF-κB信號通路變化的影響,以降低牙周膜細胞凋亡。

脂多糖是由脂肪、多糖組成的大型分子,是其復合的產物,革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的主要成分是脂多糖,是革蘭陰性厭氧菌中的一種致病物質[10]。脂多糖作為一種內毒素,可以引發強烈的免疫反應,可以作為膜小泡維持正常的運輸生理活動,具有獨特的難滲透性,可以有效幫助細菌細胞抵御外界有害刺激,避免胞膜受到攻擊,具有抗原性,可以穩定整個胞膜的結構,為細菌的結構完整性做出了巨大貢獻,但是脂多糖可以加快蛋白的表達,可以加快炎性細胞因子與其他炎性介質的合成、釋放,引起炎性反應,致使牙周膜細胞凋亡加速,抑制了細胞的增殖[11-13]。白藜蘆醇具有抗氧化的作用,是一種天然的抗氧化劑,是遭受真菌病害感染反應后分泌的一種抗毒素,具有抗氧化、抗炎、免疫調節,保護心血管的功能,具有特殊的生物活性,生物轉化操作簡單,可以在葡萄的葉子和葡萄皮中反應合成,可以在肝臟內迅速代謝,有益于人類生命健康[14-16]。本文研究發現,白藜蘆醇是一種有效的抗氧化物,對脂多糖引起的細胞凋亡具有保護作用,進而維持牙周膜細胞的功能,白藜蘆醇濃度大小可以有效調節牙周膜細胞由于脂多糖參與下的細胞增殖、凋亡水平,白藜蘆醇低濃度下,牙周膜細胞增值率降低,凋亡率升高,白藜蘆醇高濃度參與下,牙周膜細胞增值率升高,凋亡率減少,所以需要更好的調控白藜蘆醇濃度,降低牙周膜細胞的凋亡率。相關學者研究發現,牙周膜細胞在維持牙周功能方面具有重要的作用,牙周膜細胞的凋亡往往導致了更嚴重的牙周損傷,脂多糖明顯增加牙周膜細胞內活性氧的水平,導致細胞凋亡加速[17-19],與本文研究保持一致。表明在白藜蘆醇作用下,可以有效的抑制脂多糖誘導的細胞凋亡,降低牙周膜細胞內活性氧的水平,以改善牙周膜細胞的異常狀況。

p38 MAPK通路蛋白是MAPK家族的成員,參與炎性因子的調控,加劇炎性反應,是通路下游的重要因子[20]。NF-κB信號通路調控著多類細胞因子的表達,調節炎性因子的釋放,在炎性損傷及細胞再生方面發揮著重要作用,與牙周炎性有著密不可分的聯系[21]。正常情況下p38 MAPK/NF-κB均處于未激活狀態,當受到炎性刺激時,通路活化,抑制通路激活,減少炎性因子的釋放,維護牙周健康[22,23]。本文研究發現,在發生氧化應激時,激活了p38 MAPK/NF-κB通路蛋白,水平表達明顯上升,通過白藜蘆醇的參與,調控著p38 MAPK/NF-κB表達水平,高劑量白藜蘆醇可以抑制p38 MAPK/NF-κB表達水平,抑制炎性發生反應。相關學者研究發現,p38 MAPK通路蛋白在正常情況下處于未激活狀態,激活后則會抑制牙周細胞增殖率,p38 MAPK通路蛋白高表達,炎性因子水平增加,影響增殖、凋亡情況[24,25],與本文研究保持一致。表明在白藜蘆醇調控下,p38 MAPK/NF-κB蛋白水平得到抑制,降低了炎性因子的反應,改善了牙周健康。

綜上所述,在脂多糖可以誘導牙周膜細胞凋亡的情況下,白藜蘆醇調控牙周細胞效果顯著,率、凋亡率,發揮出最強烈的抑制病情的作用,且該作用機制可能與p38 MAPK/NF-κB信號通路被激活有緊密的關聯。