N-乙酰半胱氨酸抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡對前列腺癌的治療作用

徐梅 魏雯

前列腺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,是男性死于癌癥的第二大原因[1,2]。前列腺癌大多數發生于>65歲男性,其與遺傳和環境因素相關,如飲食習慣、生活方式、缺乏運動能力和吸煙等[3]。目前,臨床治療前列腺癌的方法多種多樣,包括化療、前列腺切除術及抗雄激素治療等[4]。抗雄激素治療是前列腺癌患者早期的主要治療方法,但患者對抗雄激素治療出現耐藥性[5],因此,尋找用于治療前列腺癌的藥物是前列腺癌治療的一項重要策略。N-乙酰半胱氨酸是一種抗氧化劑,具有抗氧化、粘液溶解和抗炎等多種活性[6,7]。N-乙酰半胱氨酸在體內和體外均具有抗腫瘤效應,降低腫瘤細胞侵襲性和促腫瘤細胞凋亡[8]。本研究通過體內外實驗評價了N-乙酰半胱氨酸的潛在抗前列腺癌作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物科技有限公司(中國);Anti-MMP-2,Anti-caspase3,Anti-p38,Anti-GAPDH抗體均購自Cell Signaling生物公司(美國);N-乙酰半胱氨酸注射液購自杭州民生藥業有限公司(中國)。

1.2 動物 SPF級別6月齡雄性裸小鼠40只,體重18～20 g,購于新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2021-0001。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養:人前列腺癌PC3細胞購買于ATCC(美國),用含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的1640細胞培養基于37℃和5% CO2條件下,培養于二氧化碳細胞培養箱。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗:以1×106個/ml密度將PC3細胞接種于96孔板,過夜培養,待細胞長至80%時,用不同濃度的NAC(0、2.5、5和10 μmol/L)處理24 h,用MTT液檢測細胞活力。

1.3.3 細胞克隆形成實驗:將細胞以1 000個/孔接種于6孔板,按上述給藥濃度給予藥物,并培養7 d,隨后用1%結晶紫溶液對細胞染色,拍照并計數。

1.3.4 細胞劃痕實驗:將PC3細胞接種于6孔細胞培養板中,培養細胞達80%時,按上述給藥濃度給予藥物,然后用移液管吸頭刮擦單層前列腺細胞,拍照觀察細胞的遷移能力。

1.3.5 流式細胞凋亡分析實驗:取對數期生長的PC3細胞,消化成單細胞懸浮液,稀釋細胞數至1×104個/ml,接種于96孔板,100 μl/孔,待細胞貼壁后,按上述給藥濃度給予藥物,加Annexin-V-FITC/PI標記后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 荷瘤裸鼠模型:動物實驗均通過我院倫理委員會的批準,腹側皮下注射PC3細胞,每只裸鼠皮下注射5×105個細胞。待背部皮下出現顆粒大小的硬結節,即造模成功。選擇造模成功的裸鼠40只,隨機分為對照組,N-乙酰半胱氨酸組(12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg)和陽性對照組(PBS),每組8只。從接種細胞后第2周開始,腹腔注射N-乙酰半胱氨酸,陽性對照組注射氟他胺(20 mg/kg),對照組注射等體積0.9%氯化鈉溶液,每3天1次,連續6周。腫瘤塊出現后,每周測量一次腫瘤塊體積(TV)。用游標卡尺測量腫瘤塊的最大直徑(A)和最小直徑(B),按公式TV=0.5 × A × B2計算。

1.3.7 RT-PCR法:收集荷瘤裸鼠腫瘤組織,加1mLTrizol,組織研磨儀勻漿,提取組織總RNA,用NanoDrop 2000檢測RNA的濃度和純度,用PrimeScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser將RNA(1 μg)逆轉錄為cDNA,使用配有SYBRs Green Master Mix的CFX ConnectTMReal-Time系統進行qRT-PCR定量分析,計算MMP2、p38、caspase3相對于GAPDH mRNA的表達水平,引物序列:MMP2-Forward:5’-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3’;MMP2-Reverse:5’-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3’;caspase3-Forward:5’-CAGCACCTGGTTATTATTCT-3’;caspase3-Reverse:5’-TTGTCGGCATACTGTTTC-3’;p38-Forward:5’-GCTGTGAATGAAGACTGTGAG-3’;p38-Reverse:5’-GCATCCCACTGACCAAATATC-3’;GAPDH-Forward:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’;GAPDH-Reverse:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western blot)法:提取組織和細胞總蛋白,采用BCA法蛋白定量,加入Loading buffer(4×)于100℃煮沸5 min,然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白。隨后采將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏佛乙烯膜,用5% BSA室溫封閉60 min,用一抗(MMP2,caspase3,p38和GAPDH,按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,用二抗室溫孵育90 min,用ECL化學發光法顯影檢測,ImageJ分析灰度值。

2 結果

2.1 4組PC3細胞活力和細胞克隆形成比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5、5和10 μmol/L)組的細胞活力和存活菌落顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組PC3細胞活力和細胞克隆形成比較 n=3,%,

2.2 4組PC細胞MMP-2、p38和caspase-3表達比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5、5和10 μmol/L)組細胞中MMP2和p38表達水平顯著下調,caspase3的表達水平顯著上調(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 4組PC細胞MMP-2、p38和caspase-3表達

表2 4組PC細胞MMP2、p38和caspase3表達結果比較 n=3,

2.3 4組PC3細胞遷移和凋亡情況比較 與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L,5 μmol/L和10 μmol/L)組PC3細胞的遷移能力降低。與對照組(0 μmol/L)相比,N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)組的細胞凋亡率升高,分別為2.1%、25.8%、49.0%和86.1%。見圖2。

圖2 N-乙酰半胱氨酸對PC3細胞遷移能力和細胞凋亡的影響;A 細胞劃痕實驗結果;B 流失細胞分析凋亡實驗結果

2.4 4組荷瘤裸鼠腫瘤塊體積和重量比較 與對照組相比,N-乙酰半胱氨酸(12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg)組小鼠的腫瘤塊的體積和重量顯著減小(P<0.05)。見表3。

表3 5組荷瘤裸鼠腫瘤塊體積和重量比較 n=8,

2.5 荷瘤裸鼠腫瘤組織中MMP2、p38和caspase3表達水平比較 與對照組相比,N-乙酰半胱氨酸(12.5、25和50 mg/kg)組MMP2和p38表達水平顯著下調,caspase3表達水平顯著上調(P<0.05)。見表4。

表4 腫瘤組織中MMP2、p38和caspase3表達水平比較 n=8,

3 討論

N-乙酰半胱氨酸作為一種抗氧化劑,具有抗乳腺癌細胞增殖效應,但對前列腺癌的作用和機制依然不太清晰。因此,本研究采用體外PC3前列腺癌細胞和體內荷瘤裸鼠模型評價了N-乙酰半胱氨酸的抗前列腺癌活性和分子機制。

不同的腫瘤細胞均具有相同的生物學特征,如對細胞死亡信號無反應,不能正常凋亡;不受控制地增殖;能夠遷移并擴散至其他細胞或身體部位,發生轉移;能夠形成新的血管等[9]。因此,尋找同時針對多種腫瘤生物學特征的藥物是腫瘤治療的一項重要策略。本研究首先評價了N-乙酰半胱氨酸對PC3細胞的抗增殖、促凋亡和抗腫瘤細胞轉移效應,發現不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)均可抗腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡和抗腫瘤細胞遷移,這表明N-乙酰半胱氨酸同時作用于多種腫瘤細胞生物學特征,并產生抗前列腺癌效應。

N-乙酰半胱氨酸的抗腫瘤活性與腫瘤細胞增殖和凋亡相關信號分子的表達有關。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是細胞內轉導信號通路,包括細胞外調節蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK亞型[10,11]。p38 MAPK通過蛋白激酶調節細胞增殖、分化及細胞死亡和腫瘤抑制[12,13]。細胞凋亡通過內在和外在凋亡細胞途徑調節,內在信號途徑中,線粒體細胞色素C釋放激活胱天蛋白酶(caspase)-9和caspase-3,在后一種途徑中,配體與其死亡受體相互作用將激活caspase-8和caspase-3,因此,caspase-3在細胞凋亡信號中起著至關重要的作用,是細胞凋亡的重要標志物[14,15]。轉移是腫瘤后期的主要特征,基質金屬蛋白酶(MMP)通過降解細胞外基質蛋白在腫瘤轉移過程中起著至關重要的作用,MMP-2廣泛高表達于腫瘤細胞,與腫瘤轉移密切相關[16,17]。本研究認為N-乙酰半胱氨酸對癌細胞遷移和轉移的抑制作用與MAPK信號有關,因為轉化生長因子-β(TGF-β)介導的MMP-2的誘導依賴于p38 MAPK途徑的激活[18,19]。本研究表明N-乙酰半胱氨酸抑制了PC3細胞中p38表達,并且上調caspase-3和MMP-2表達。

本研究體外結果表明N-乙酰半胱氨酸具有抗腫瘤細胞增殖、促凋亡和抑制癌細胞轉移效應,并且其可能與調節p38,caspase-3和MMP-2蛋白表達有關。因此,接下來本研究通過建立體內荷瘤裸鼠模型評價了N-乙酰半胱氨酸的體內生物學活性,發現與對照組相比,腹腔注射N-乙酰半胱氨酸能夠抑制荷瘤裸鼠腫瘤塊的形成,并呈劑量依賴性下調腫瘤組織中p38表達,并上調caspase-3和MMP-2表達。上述結果表明N-乙酰半胱氨酸在體內也具有抗腫瘤活性,并與調節p38,caspase-3和MMP-2表達有關。

綜上所述,通過體內外實驗表明N-乙酰半胱氨酸具有潛在的抗前列腺癌作用,并且這種作用與調節p38,caspase-3和MMP2蛋白表達有關。但N-乙酰半胱氨酸是否能夠通過其他信號通路產生抗前列腺癌作用依然是未知的,需要進一步研究。