胃癌微環境中CAFs、THBS4的臨床意義及與預后的關系

劉紅芬 王征

胃癌是世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一,且在我國的病發率及死亡率均處于較高水平,惡性程度極強,多數患者一經確診既為中晚期[1]。在目前臨床中,對于中晚期胃癌的治療缺乏準確且有效的檢測手段,因此需要迫切尋求對于胃癌早期診斷、治療方案及預后判斷具有指導價值的客觀指標[2]。血小板反應蛋白4(THBS4)是通過調節細胞外基質組織的修復和重塑而參與創面愈合和組織重塑的細胞外分泌糖蛋白之一[3,4]。有報道稱,THBS 4常在乳腺癌及前列腺癌等實體癌腫瘤基質中表達[5]。周瀟等[6]表示THBS 4是彌漫性胃癌的重要標志物,且在腫瘤間質中檢測到THBS4的表達。雖然已有此類文獻對THBS 4進行了報道,但THBS4在胃癌發生發展中的意義一直存在爭議。目前,很少有研究證實THBS4在胃癌中的臨床病理意義,故此本研究旨在探討THBS 4在胃癌中的臨床病理意義,尤其是在腫瘤間質中的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015至2018年在我院行手術切除的100例胃癌組織標本,其中男63例,女37例;年齡31～74歲,中位年齡58歲;腫塊<5 cm 60例,≥5 cm 40例;低分化癌28例,中分化癌48例,高分化癌24例;依據國際抗癌聯盟發布的第8版AJCC胃癌病理分期標準:Ⅰ～Ⅱ期66例,Ⅲ～Ⅳ期34例。依據腫瘤組織中THBS4的表達,將患者分為THBS4高表在組(n=38)和THBS4低表達組(n=62)?；颊咝g前均未接受任何放化療,且術后繼續進行隨訪研究3年。

1.2 方法 采用免疫組織化學Elivision二步法檢測,胃癌組織用10%甲醛固定,石蠟包埋,連續切片4 μm,脫蠟至水化;高溫抗原修復;室溫下3%H2O2培養10 min;阻斷內源性過氧化物酶;隨后加入抗α-SMA抗體濕盒培養1 h。使用PBS沖洗3 min×3次,加入二抗培養30 min。使用DAB進行顯色,加入850 μl蒸餾水、50 μl DAB、50 μl底物及50 μl底物稀釋液。一抗全部使用pH=6.0檸檬酸鹽進行微波熱修復。每一批染色均進行陽性和陰性對照。Polymer免疫組織化學法進行染色,鏡下尋找最佳顯色位置,染色完成后立即停止,后使用蒸餾水停止顯色反應。切片使用蘇木素染液進行1 min染色,后加入梯度乙醇脫水,二甲苯浸泡至切片透明,使用樹膠封片?？贵w均購置于Abgent公司。切片出現棕黃色顆粒細胞則判定為α-SMA陽性。

1.3 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件,Chi-square檢驗分析THBS4、α-SMA在胃癌組織中表達及其與患者臨床病理特征的關系,生存率用Kaplan-Meire法生存曲線圖表示,并用log-rank檢驗比較生存曲線,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THBS4的表達與臨床病理特征的關系 THBS4-高表達與高α-SMA表達顯著相關;與≥5腫瘤直徑,高腫瘤浸潤深度,淋巴結轉移,臨床Ⅲ、Ⅳ期,腫瘤分化程度顯著相關(P<0.001),且低分化腫瘤組織中THBS4的表達明顯高于高或中分化腫瘤組織(P<0.001),與患者年齡、性別及遠處轉移無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 THBS4 的表達與臨床病理特征的關系 例(%)

2.2 α-SMA表達與與臨床病理特征的關系 胃癌組織CAFs中α-SMA的表達與≥5腫瘤直徑,淋巴結轉移顯著相關(P<0.05);與性別、年齡、及組織學分級無關(P>0.05)。見表2。

表2 α-SMA表達與與臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 2組患者生存率比較 高THBS4表達組3年生存率(41.03%)明顯低于低THBS 4表達組(64.57%)差異有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 高、低THBS4表達患者生存曲線

3 討論

THBS4是一種細胞外基質,可以對細胞的增生、黏附及神經細胞的成熟起到促進作用。相關研究結果顯示,胃癌病灶內含有大量新生血管,新生的血管結構不完整、血流阻力較小,流量較大,可以為癌細胞的增殖提供足夠的養分,因此,血管新生在腫瘤的發展過程中具有重要的影響[7-9]。而由于THBS4的結構中缺少原膠原同源區及備解素重復序列,無法調節血管內皮細胞的增殖與凋亡,因此THBS4會對新血管的生成起到促進作用,從而影響到腫瘤的發展[10,11]。

筆者發現,目前,THBS4在關于胃腫瘤方面的研究較少,Kuroda等[12]的研究觀察到在胃癌腫瘤(尤其是腫瘤微環境中的間質細胞)有著THBS4的表達,而THBS4的基質細胞也有著CAFs標志物的表達,并通過蛋白質印記實驗表明THBS4是從CAFs表達的,而不是從正常成纖維細胞和癌細胞系表達。本次研究中,通過病例分析顯示,THBS4的高表達與α-SMA的高表達相關,這些發現提示,在胃癌中,THBS4可能是由CAFs表達的。有的研究結果表明,用人彌漫性胃癌細胞系的條件培養基孵育可刺激CAFs上THBS4的轉錄[13]。由此可以推測腫瘤細胞來源的轉化生長因子β刺激CAFs上THBS4的表達,從而導致血管生成和腫瘤進展。

腫瘤細胞微環境中的細胞成分包括免疫細胞、內皮細胞及成纖維細胞,其中成纖維細胞的數量最多,分布最廣[13-15]。且與正常組織內的成纖維細胞相比,腫瘤細胞微環境中的成纖維細胞處于活化狀態,在表型和功能上有著顯著變化,且會通過多種信號轉導和生物因子影響到腫瘤的發生、轉移和浸潤以及新生血管的生成等。CAFs的高表達可以為癌細胞的增生以及浸潤創造基礎[16]。

本次研究結果發現,THBS4-高表達與高α-SMA表達顯著相關;與≥5 cm腫瘤直徑,高腫瘤浸潤深度,淋巴結轉移,臨床Ⅲ、Ⅳ期,腫瘤分化程度顯著相關(P<0.001),且低分化腫瘤組織中THBS4的表達明顯高于高或中分化腫瘤組織(P<0.001),與患者年齡、性別及遠處轉移無相關性(P>0.05)。胃癌組織CAFs中α-SMA的表達與≥5 cm腫瘤直徑,淋巴結轉移顯著相關(P<0.05);與性別、年齡、及組織學分級無關(P>0.05)。這說明,在腫瘤的發展過程中,高THBS-4表達與腫瘤發展程度顯著相關,且證實了CAFs上的THBS-4是胃癌的發展獨立相關。通過對患者生存率進行比較,發現高THBS4表達組3年生存率(41.03%)明顯低于低THBS 4表達組(64.57%)差異具有統計學意義(P<0.001)。尤其是Ⅰ期和Ⅲ期高表達Thbs 4患者的預后明顯低于Ⅰ期和Ⅲ期低表達組。說明基質細胞中Thbs 4的高表達是胃癌患者預后的獨立因素。CAFs中的Ths4可以作為胃癌患者(尤其是Ⅰ、Ⅲ期胃癌患者)的的預后指標。

綜上所述,Thbs 4在胃癌微環境中表達,CAFs中的THBS4與發展密切相關,且可以作為胃癌患者的預后評估指標。