基于HPLC測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量的方法學研究

張苗露,董平原,孫延紅,熊 彪,張春鳳

(1.中國藥科大學 中藥學院,江蘇 南京 211198;2.江西地康藥業有限公司,江西 贛州 342200)

五味通栓口服液收載于國家藥品標準WS3-370(Z-049)-2003(Z),由黃芪、水蛭、川芎、當歸、丹參五味中藥制成,具有益氣活血、化瘀通絡的功效,主治腦梗(急性期)中風中經絡氣虛血瘀證[1]。五味通栓口服液處方是依據清代王清任著作《醫林改錯》中“治病之要訣,在于明白氣血”“元氣既虛,必不能達于血管,血管無氣,必停留內瘀”等理論[2],對補陽還五湯進行化裁,在多年臨床實踐中發明的協定處方。氣虛鼓動無力,令血瘀脈絡而成中經絡之證,若氣不充,血終難暢,其治必以益氣為先,以率血行,故以黃芪為君藥[3],其味甘性溫,歸經入脾,補中益氣,《本草求真》認為黃芪入肺補氣,入表實衛,為補氣諸藥之最[4]。因此,黃芪為本處方補氣逐瘀的立方基礎。

黃芪的化學成分眾多,主要有皂苷類、黃酮類、多糖類及多肽、氨基酸類[5]。三萜及甾體皂苷是黃芪重要的次生代謝產物,骨架主要為黃芪醇型和齊墩果烷型,主要包括黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)、異黃芪皂苷Ⅰ、大豆皂苷Ⅰ、胡蘿卜苷等[6],具有抑制一氧化氮釋放、降低甘油三酯水平、促進細胞攝取葡萄糖、免疫調節等活性[7-8]。黃芪甲苷常作為黃芪藥材和含黃芪的中藥制劑的質量控制指標。《中華人民共和國藥典》2020版黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定項下,使用含氨試液的甲醇溶液提取黃芪藥材[9],可除去黃酮類、酚酸類物質,并使黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黃芪皂苷Ⅰ等其他皂苷類轉化為黃芪甲苷[10],因此該方法測得黃芪甲苷含量包含了藥材中原始含量與轉化量[11]。不同堿處理方法和處理時間會影響黃芪甲苷的得率[12]。

黃芪甲苷為黃芪藥材中指標有效成分,建立一種快捷、準確的黃芪甲苷含量測定方法對五味通栓口服液質量控制的意義重大。現行標準中使用薄層掃描法測定黃芪甲苷含量,該方法容易受人為因素及環境因素的干擾,且重復性、準確性不高。本研究建立了高效液相色譜法測定黃芪甲苷含量的方法,并與薄層掃描法進行了對比。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BT125D十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);BSA323S千分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);HHS-21-4型數顯恒溫水浴鍋(上海博訊實業有限公司);KH-3000Plus型薄層色譜掃描儀(上海科哲生化科技有限公司);Series Ⅲ型高效液相色譜儀,蒸發光散射檢測器(美國Lab Allience)。

1.2 材料

黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:110781-201717,純度96.9%);正丁醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20200815);氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20180308);氯仿(萊陽經濟技術開發區精細化工廠,批號:201807 05);硫酸(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20170708);95%乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20200408);甲醇(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20201111);乙腈(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20200831);硅膠G薄層板(青島海洋化工廠);Venusil XBP-C18(L)色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)(Agela Technologies,批號:VX952505-L);ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)(Agilent,批號:883975-902);五味通栓口服液(山東勝利藥業有限公司,批號:201001)。

2 方法與結果

2.1 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量

2.1.1 溶液的配制 (1)對照品溶液的配制:精密稱取黃芪甲苷對照品9.280mg、12.050mg,分別加入甲醇溶解并定容至10mL,制成濃度為0.928mg/mL、1.205mg/mL的對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備:精密量取五味通栓口服液20mL,置分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取4次,每次20mL。合并正丁醇提取液,用2%氫氧化鈉溶液洗滌2次,每次20mL,棄去堿液。用正丁醇飽和的水30mL洗滌1次,棄去水液。收集正丁醇層,置水浴鍋蒸干,殘渣加甲醇溶解并轉移至2mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得。平行制備2份。

2.1.2 測定方法及標準規定 薄層板:硅膠G板(20cm×10cm)。使用前110℃活化30min,點樣量及點樣方法見表1。展開劑:三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液(展開劑混合均勻,放置于分液漏斗中,在2～8℃靜置分層,取下層溶液)。顯色劑:10%硫酸乙醇。檢測波長:510nm。將薄層板放入薄層掃描儀中,進行薄層掃描,記錄各樣品峰面積積分、Rf值,要求相同樣品的峰面積積分RSD≤10%,0.2≤Rf≤0.8。外標法計算供試品濃度。標準規定:五味通栓口服液每支(10mL)含黃芪以黃芪甲苷計,不得少于0.25mg。

表1 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量點樣方法

2.1.3 測定結果 薄層掃描法測定結果(詳見表2),黃芪甲苷含量(mg/支)=(0.392 2+0.400 0)/2×2/20×96.9%×10=0.38>0.25。薄層掃描法測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量為0.38mg/支,符合規定。

表2 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量結果

表3 加樣回收率考察結果

表4 線性關系

2.2 高效液相色譜法測定黃芪甲苷含量

2.2.1 溶液的配制 ①對照品溶液的配制:精密量取“2.1.1”項下0.928mg/mL黃芪甲苷對照品溶液1mL,分別加甲醇定容至10mL、2mL,得到濃度為0.092 8mg/mL、0.464 0mg/mL的對照品溶液。②供試品溶液的制備:精密量取五味通栓口服液20mL,置分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取4次,每次20mL。收集正丁醇提取液,用2%氫氧化鈉溶液洗滌2次,每次20mL,棄去堿液。用正丁醇飽和的水30mL洗滌1次,棄去水液,收集正丁醇層,水浴蒸干,殘渣用甲醇溶解并轉移至5mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。③陰性樣品溶液的制備:按五味通栓口服液處方比例,按標準制備工藝制成缺黃芪的陰性樣品,按②供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及測定法 采用Venusil XBP-C18(L)色譜柱,以乙腈-水(32∶68)為流動相,柱溫30.0℃,流速1.0mL/min,進樣量10μL,蒸發光散射檢測器(ELSD)檢測。理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于4 000。記錄色譜圖,以外標兩點對數方程計算供試品含量。

2.2.3 方法學考察 (1)系統適用性考察。取對照品溶液連續進樣6次,記錄保留時間、主峰面積、理論板數。主峰的保留時間相對一致(±1min),主峰峰面積對數的RSD=0.28%,理論塔板數按黃芪甲苷峰計算均不低于4 000。表明系統適用性及儀器的精密度良好。

(2)專屬性考察。分別取對照品溶液、缺黃芪的陰性樣品溶液、供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖1-圖3。供試品溶液的主峰保留時間與對照品溶液主峰保留時間一致(±1min),周圍無雜質峰干擾;陰性樣品溶液色譜圖在與黃芪甲苷對照品相同的出峰時間內無相應的峰,表明該方法的專屬性良好。

圖1 黃芪甲苷對照品溶液色譜

圖2 缺黃芪陰性樣品溶液色譜

圖3 供試品溶液色譜

圖4 黃芪甲苷線性回歸方程

圖5 對照品溶液外標兩點對數方程

(3)重復性考察。取同一樣品,同法制備6份供試品溶液,分別進樣,記錄保留時間、主峰面積、理論塔板數,計算供試品含量。主峰的保留時間相對一致(±1min),供試品平均含量為0.079 91mg/mL,供試品含量的RSD=2.1%,表明該方法重復性良好。

(4)準確度考察。在線性范圍內,于供試品中精密加入一定量的對照品溶液,設計3種不同濃度,每種濃度分別制備3份供試品溶液進行測定,用9份樣品的測定結果進行評價。高、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測成分量之比控制在1.5∶1,1∶1,0.5∶1。記錄供試品取樣量,供試品中含有量,對照品加入量,測定結果,回收率(%)及其相對標準偏差。回收率=(實測值-供試品中含有量)/加入對照品量×100%。

(5)線性關系考察。精密量取“2.1.1”項下0.928mg/mL黃芪甲苷對照溶液1mL、1mL、2mL、3mL、5mL,分別加甲醇定容至10mL、5mL、5mL、5mL、5mL,作為線性工作液1-5。分別進樣,記錄保留時間、理論塔板數、主峰面積。以濃度的對數為橫坐標,以峰面積的對數為縱坐標,作線性回歸方程,得到回歸方程為y=1.418 6x+6.319,相關系數r=0.999 8。表明黃芪甲苷的濃度在0.092 8～0.928 0mg/mL時,峰面積對數與濃度對數呈現良好的線性關系。

(6)色譜柱耐用性考察。使用不同色譜柱,測定同一供試品,計算其含量及RSD,詳見表5。兩種色譜柱測定同一供試品的結果表明,由于柱長不同,短柱出峰時間提前了8min,理論塔板數有所下降,但仍符合理論塔板數>4 000的要求。計算供試品含量,RSD<2.0%,表明兩種不同型號、規格的色譜柱對供試品含量測定沒有顯著影響,均可使用。

表5 色譜柱耐用性考察結果

(7)溶液穩定性考察。取供試品溶液,密封保存。在制備后第0、8、12、24h進樣測定,記錄保留時間、理論塔板數、主峰面積,計算供試品中黃芪甲苷的含量。由表6可得,主峰的保留時間相對一致(17.6±1min),供試品中黃芪甲苷含量的相對標準偏差<2%,表明供試品溶液在密封條件下,穩定性良好,可保存24h。

表6 供試品溶液穩定性考察結果

2.2.4 樣品測定 取與“2.1”薄層掃描法含量測定項下使用的相同樣品,按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法進行處理,測定結果見表7。

表7 供試品黃芪甲苷含量測定結果

以對數方程計算供試品濃度。

含量計算公式:含量(mg/支)=濃度×5/20×96.9%×10

色譜基線分離,無干擾,供試品溶液主峰保留時間與對照品溶液主峰保留時間相對一致,主峰周圍無雜峰干擾。HPLC-ELSD測得五味通栓口服液中黃芪甲苷含量為0.831 2mg/支。

3 討論

本研究建立了HPLC-ELSD測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量的方法,確定了供試品制備方法,確定了色譜條件:使用Venusil XBP-C18(L)色譜柱或ZORBAX SB-C18色譜柱,以乙腈-水(32∶68)為流動相,柱溫30.0℃,流速1.0mL/min,進樣量10μL,ELSD檢測。方法學考察結果表明,該方法的系統適用性、專屬性、重復性、準確度、線性、色譜柱耐用性、溶液穩定性符合規定,其中,重復性和準確度的限度要求來源于《中華人民共和國藥典》2020版中9101分析方法驗證指導原則[13]。與五味通栓口服液現行質量標準中薄層掃描法相比,操作簡單快捷,準確度更高,重復性更好,受人為因素影響小。對同一供試品,薄層掃描法測得含量為0.38mg/支,本方法為0.831 2mg/支。說明在相同的供試品處理方法下,薄層掃描法因其方法本身所限,測得黃芪甲苷含量偏低,對產品質量控制檢測局限性更大。可將HPLC-ELSD測定黃芪甲苷含量作為五味通栓口服液質量控制的方法。