摘花摘果對牡丹皮品質的影響研究:基于特征化學成分

李光全,王云紅,陶 敏,王 丹,劉 丹,彭 瑾,王壽明,劉成鼎*

(1.重慶市墊江縣中醫院 藥學部,重慶 408300;2.重慶市中藥研究院,重慶 400065)

牡丹皮Moutan Cortex為毛茛科芍藥屬植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮,始載于《神農本草經》,具有清熱涼血、化瘀活血等功效,主要用于熱入營血、溫毒發斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經閉痛經、跌撲傷痛、臃腫瘡毒等癥[1]。牡丹皮在我國已有2 000多年的藥用歷史,是臨床常用中藥之一,如《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(第九版)[2]就推薦將其與別的藥配伍用作新冠肺炎重癥患者氣營兩燔證的治療。

在孕蕾期摘除花蕾是牡丹皮規范化種植的技術要求[3-4],其原因是該方法可以減少營養消耗、提高牡丹皮的產量。然而,產量高不等于品質好,此方法能否提高藥材品質,可從化學成分方面進行研究。因此,本研究在前期研究成果的基礎上[5],以浸出物、丹皮酚及主要特征化學成分含量為評價指標,進一步考查了摘花摘果對牡皮品質的影響,現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司),配紫外檢測器(SPD-20A);LabSolutions色譜分析軟件;CP214型萬分之一天平(奧豪斯儀器[上海]有限公司);DV215CD型十萬分之一天平(奧豪斯儀器[上海]有限公司);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司);2500A型多功能粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗藥材 試驗牡丹為種植在重慶市墊江縣沙坪鎮雙塘村的牡丹,按試驗需要分別進行如下處理:花蕾期摘花(摘花組),花凋謝時摘果(摘果組),不摘花果(對照組)。其具體栽培條件、試驗處理、采收方法同前期研究[5]。采收并測量根徑后,剪取牡丹根(最粗端10cm)作為檢測樣本,按《中國藥典》2020版方法制成“連丹皮”并趁鮮切成薄片,按各樣本的組別歸屬分別存放,經50℃烘干,制成對照組、摘花組、摘果組飲片。

1.2.2 藥品與試劑 丹皮酚(批號:110708-201908,純度:99.8%,中國食品藥品檢定研究院);乙醇(AR,批號:2021052402,成都科隆化學品有限公司);乙腈(色譜純,批號:011210801,美國BCR試劑公司);超純水,自制。

2 實驗方法

2.1 浸出物測定

取對照組、摘花組、摘果組牡丹皮飲片適量,分別打粉過二號篩。每組平行取樣3份(共9個試驗樣本),按照《中國藥典》2020版4部“醇溶性浸出物測定法”(通則2201)項下的熱浸法進行測試。即取本品粉末約2.5g,精密稱定,置250mL錐形瓶中,加乙醇100mL,密塞,稱定重量,靜置1h后,連接回流冷凝管,水浴加熱至沸騰,并保持微沸1h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用乙醇補足減失的重量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取濾液25mL(再量取10mL留作HPLC指紋圖譜檢測),置于干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干,于105℃干燥3h,置干燥器中冷卻30min,精密稱定重量,直至恒重;以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液制備 按“2.1”項下方法操作,留取的濾液過0.22μm濾膜,即得供試品溶液。

2.2.2 丹皮酚對照品溶液制備 精密稱取丹皮酚對照品7.07mg,加乙醇定容至5mL,配制成質量濃度為1.414mg/mL的對照品溶液,于4℃冰箱中避光保存備用。本研究用到的其他對照品因不用做定量分析,其配制方法不再贅述。

2.2.3 色譜條件 納普ChromCore 120 C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相為乙腈-0.01%磷酸水,流速1.0mL/min,柱溫30℃,進樣量10μL,檢測波長250nm,梯度洗脫:0～5min,10%乙腈;5～40min,10%～20%乙腈;40～60min,20%～50%乙腈;60～70min,50%～60%乙腈;70～75min,60%～95%乙腈;75～80min,95%～10%乙腈;80～90min,10%～10%乙腈。

2.2.4 指紋圖譜建立 將9個牡丹皮試驗樣品按“2.2.1”項方法處理后按照“2.2.3”項下方法進行HPLC分析,再將各HPLC色譜圖數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”,建立指紋圖譜,并進行相似度分析。

3 結果與分析

3.1 摘花摘果對牡丹皮浸出物的影響

藥材浸出物是衡量中藥材質量的重要指標,本研究按實驗方法測定供試品溶液,測定結果見表1。結果顯示,摘花組、摘果組和對照組醇溶性浸出物的測定結果均高于藥典要求(不得少于15.0%)。其中對照組浸出率最小,平均為21.05%;摘花組和摘果組浸出物含量差異不大,均比對照組高約6%。結果表明,摘花摘果處理均可提高牡丹皮醇溶性成分的含量。

表1 摘花摘果不同處理牡丹皮的浸出物

3.2 摘花摘果不同處理牡丹皮指紋圖譜相似度評價

將9個牡丹皮試驗樣本HPLC圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”,設定S6為參照圖譜,采用平均數法,時間窗寬度為0.1,進行多點校正、匹配,生成對照圖譜(圖1)。根據指紋圖譜情況,選定具有代表性的8個共有色譜峰作為特征峰(特征峰選擇依據:①峰型及分離度均良好;②不同極性段;③已知的活性指標成分)。通過與對照品圖譜比對、查閱文獻資料共指認出5個色譜峰(圖1),分別為1號色譜峰沒食子酸、2號色譜峰氧化芍藥苷、5號色譜峰芍藥苷、7號色譜峰苯甲酰芍藥苷、8號色譜峰丹皮酚。整理出各樣品8個特征峰的保留時間和峰面積,得到表2和表3。根據表2數據,各共有峰相對保留時間的RSD在0.05%～1.92%(<5%),表明不同處理下各特征化學成分組成基本一致。將9個牡丹皮樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜匹配,進行相似度評價,結果各批次牡丹皮與對照指紋圖譜之間的相似度在 0.978～0.998,表明各樣本之間一致性較好。

圖1 9個不同牡丹皮樣本指紋圖譜

表2 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的保留時間

表3 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的峰面積

3.3 摘花摘果對牡丹皮丹皮酚含量的影響

丹皮酚是牡丹皮的重要有效成分,也是其質量標志指標之一?！吨袊幍洹?020版規定牡丹皮含丹皮酚不得少于1.2%(按干燥品計算)。將配制好的丹皮酚對照品溶液按“3.2.3”項下方法和條件進樣,得到丹皮酚對照品溶液的HPLC圖譜(圖2)。對比圖1中各批牡丹皮樣本指紋圖譜特征峰,可將丹皮酚歸屬到8號峰。通過樣品及對照品的峰面積,計算出各實驗樣本牡丹皮含量(表4)。表中數據顯示,各組樣品丹皮酚含量均超過了1.2%,符合藥典標準。摘花組、摘果組平均丹皮酚含量均為1.35%,而對照組丹皮酚含量為1.74%。結果提示,摘花、摘果會減低牡丹皮中丹皮酚的含量。

圖2 丹皮酚對照品溶液的HPLC圖譜

表4 摘花摘果不同處理牡丹皮中丹皮酚含量

3.4 摘花摘果不同處理牡丹皮特征化學成分差異性比較

為比較摘花摘果不同處理對牡丹皮特征化學成分含量的影響,本研究通過在同一水平比較各共有特征峰的峰面積。將表3中各峰面積值分別除以對應樣本的生藥取藥量,得到各色譜峰折算峰面積(相當于每單位重量生藥的峰面積,表5)。如表5所示,各特征峰的相對峰面積RSD在2.55%～14.79%之間,表明摘花摘果處理對牡丹皮化學成分含量的影響因成分不同而有差異。為了更直觀地比較其差異,以表5數據計算出各處理組特征峰峰面積平均值,再以對照組為參照,得到各組特征色譜峰平均折算峰面積的相對值(表6)。由表6可知,相較于對照組,摘花組和摘果組各特征色譜峰的峰面積有的增加、有的減少。其中,平均峰面積增加的特征峰為3號峰、4號峰;平均峰面積減少的特征峰為1號峰(沒食子酸)、2號峰(氧化芍藥苷)、5號峰(芍藥苷)、6號峰、7號峰(苯甲酰芍藥苷)、8號峰(丹皮酚)。結果提示,摘花摘果處理對牡丹皮化學成分的影響因化學成分不同而不同。

表5 摘花摘果不同處理牡丹皮圖譜共有峰的折算峰面積

表6 特征圖譜共有峰平均折算峰面積的相對值(與對照組比較)

4 討論

已有研究表明,摘花和摘果均可提高牡丹皮產量和質量[6]。本課題組的前期研究結果也證實摘花和摘果可提高牡丹皮產量,其影響的程度與開花數量有關[5]。然而,上述結果均是從性狀、大小等方面評價,未在化學成分層面進行研究。中藥化學成分是中藥藥理作用的物質基礎,是中藥品質評控的重要指標。故本研究基于化學成分出發,以浸出率、丹皮酚和特征化學成分含量等多指標客觀評價摘花、摘果對牡丹皮品質的影響。

如表1所示,摘花、摘果均可提高牡丹皮浸出率,其中摘花效果略優于摘果。從特征指紋圖譜相似度評價來看,各樣本相似度在97.8%以上,表明摘花、摘果不會改變牡丹皮化學成分。但是,值得注意的是,通過對比各處理組丹皮酚(表4)及其他特征化學成分含量(表6),可以發現摘花、摘果對牡丹皮化學成分的影響并不一致,即在提高了某些成分含量的同時,降低了另一些成分的含量。具體到相關特征化學成分,選定的8個代表化學成分中只有2個是增加的,余下6個全部降低。被指認的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚等5個化學成分,全部歸屬于含量降低的6個特征成分中,而含量增加的3號峰和4號峰尚不明確是何種物質。上述結果表明,摘花或摘果處理提高了牡丹皮化學成分的總量,但具體到不同成分卻各有差異。沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和丹皮酚等5個成分為牡丹皮重要的質量標志物[7],本研究結果顯示,摘花和摘果后牡丹皮中上述成分的含量有所降低,據此可以認為摘花或摘果處理可能不利于牡丹皮品質的提升。

本研究結果也帶來了許多重要提示:一方面,摘花摘果會降低牡丹皮中丹皮酚等多個化學成分的含量,田云芳等[8]研究表明牡丹皮中丹皮酚含量隨生長時期而變化,其含量在花期與果熟期達到峰值,且前者更高。結合本研究,可以推測開花或結果可能有助于牡丹皮中丹皮酚等化學成分的生物合成,而摘花或摘果會減弱這種作用,不過此推測有待后期進一步驗證;另一方面,可以運用該結果進行牡丹皮種植技術指導,若以產量為導向,在牡丹皮栽種過程中可以摘花摘果,若以丹皮酚含量為代表的品質為導向,則應保留花果。

本研究有一些不足之處:首先,牡丹皮一般要種植4～5年才可采收[9],其化學成分是成年累月的增長結果,單次的摘花摘果并不能預示牡丹皮化學成分的最終變化,需進一步進行逐年的摘花摘果試驗研究,評價其對牡丹皮品質的影響;其次,本課題組的前期研究結果表明摘花摘果對牡丹皮產量的影響因開花數量不同而不同[5],而本研究在實驗設計時未按牡丹植株花蕾數量進行分組研究,摘花摘果對不同花蕾數量的牡丹皮化學成分的影響情況不得而知,這些有待進一步深入探索。