指紋圖譜結合一測多評法評價馬鞭草質量的方法學研究

王 諍,劉松照,劉叢彬,王國凱,3,謝冬梅,3,4*

(1.寧國市市場監督管理局,安徽 寧國 242300;2.安徽中醫藥大學 藥學院,安徽 合肥 230012;3.中藥研究與開發安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;4.安徽省中醫藥科學院 中藥資源保護與開發研究所,安徽 合肥 230012)

馬鞭草(Verbenae Herba)為馬鞭草科(Verbenaceae)植物馬鞭草的干燥地上部分,始載于《名醫別錄》,原產于熱帶美洲[1],其味苦、性涼,具有活血散瘀、利水退黃、解毒、截瘧的功效[2-3]。馬鞭草中主要指標性成分包括環烯醚萜苷類的馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷以及苯丙素類的毛蕊花糖苷[4-6]。目前有關馬鞭草環烯醚萜苷類及苯丙素苷類成分含量測定的報道較少,難以全面控制并評價馬鞭草藥材的質量。中藥指紋圖譜能夠較全面地反映中藥的質量特性,近年來常被用于中藥的質量評價[7]。本研究通過建立馬鞭草的指紋圖譜,結合主成分分析、聚類分析等方法對試驗數據進行處理,旨在為馬鞭草的質量評價提供科學理論依據。同時由于多指標成分的含量測定中對照品的需求較高,本研究建立了馬鞭草中3種指標性成分的一測多評法[8],并與外標法進行比較,證明所建立的方法簡便、可靠,可節省大量對照品[9],提高檢測效率,現將研究過程報道如下。

1 儀器及材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀(LC-10ATVP泵,SPD-10AVP紫外檢測器,SIL-10ADVP自動進樣器,LC-Solution色譜工作站,日本島津),Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),十萬分之一電子天平AB135-S(瑞士梅特勒托利多)。

1.2 材料

甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水;馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對照品均由本實驗室自制,純度均達98%以上。不同來源的馬鞭草藥材16 批,見表1。

表1 馬鞭草樣品16批的產地信息

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷對照品7.16、11.62、15.47mg,置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻;取1mL對照品溶液置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1mL含0.071 6mg戟葉馬鞭草苷、0.116 2mg馬鞭草苷和0.154 7mg毛蕊花糖苷的對照品儲備液。

2.2 供試品溶液制備

取藥材粉碎過80目篩,取粉末約0.5g,精密稱定,加80%甲醇25mL,置具塞錐形瓶中,稱定重量,超聲(功率100W,頻率40kHz)提取30min,冷卻至室溫。80%甲醇補足重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),檢測波長為238nm,柱溫30℃;流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),體積流量1mL/min,進樣量10μL,洗脫程序見表2。在上述色譜條件下,戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷色譜峰分離效果較好,見圖1。

注:1.戟葉馬鞭草苷;2.馬鞭草苷;3.毛蕊花苷。

表2 梯度洗脫程序

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗 取S1號樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,連續進樣6次,以2號色譜峰(馬鞭草苷)的保留時間和峰面積作為參考,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結果其RSD值均<1.5%,6次采集的指紋圖譜的相似度>0.98,表明該儀器和所用方法的精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取S1號樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測,以2號色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,并計算RSD值。結果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取S1號樣品6份,按上述方法制備6份供試品溶液,并按照“2.3”項下色譜條件測定,以2號色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,并計算RSD值。結果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的重復性良好。

2.4.4 特征指紋圖譜的建立 應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”對16批馬鞭草藥材的色譜進行分析,色譜見圖2,相似度評價結果見表3。共確定11個共有峰,其中1號峰為戟葉馬鞭草苷、2號峰為馬鞭草苷、6號峰為毛蕊花苷。經分析可知,11個共有峰保留時間的RSD均<1%,峰面積RSD值在18.33%～81.22%之間。結果顯示不同批次的馬鞭草化學成分種類相似,但部分成分的含量存在較大差異,見表4、表5。

圖2 馬鞭草16批的指紋圖譜

表3 相似度計算結果

表4 馬鞭草共有峰的保留時間 (min)

表5 馬鞭草共有峰的峰面積

2.4.5 特征指紋圖譜的結果分析 應用SPSS 23.0分析軟件對16批馬鞭草進行主成分分析(表6、表7、圖3),以特征值>1為標準,選取前3個作為主成分,其方差累積貢獻率達到84.233%。第一主成分特征值及方差貢獻率均大于第二主成分,說明第一主成分包含信息最多。由旋轉前后因子載荷矩陣可知,1號色譜峰、2號色譜峰和6號色譜峰在第一成分中有明顯的正相負荷,表明戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花苷可作為馬鞭草的指標性成分,反映樣品特性。

圖3 樣品主成分三維得分

表6 旋轉前后的特征值及方差貢獻率

表7 因子載荷矩陣

將16批馬鞭草樣品特征圖譜中11個共有峰的峰面積經均一化數據處理后作為變量,應用SPSS 23.0統計分析軟件,采用中位數聚類法,區間選取平方Euclidean距離,進行聚類分析(圖4)。當類間距為10時,16批藥材可分為兩大類,S3、S8、S9和S10分為一類,其余分為一類,與相似度評價結果較為一致。

圖4 聚類分析結果

2.5 指標性成分含量測定

2.5.1 線性關系考察 配制一系列含有戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的混合對照品溶液,按“2.3”項下條件進樣測定,以進樣濃度和峰面積分別為橫、縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線:Y=1.0×106X+925.81,r=0.999 8;Y=1.0×106X+18 654,r=0.999 6;Y=956 465X+28 464,r=0.999 5。結果表明,戟葉馬鞭草苷在0.143～3.580μg、馬鞭草苷在0.232～5.810μg、毛蕊花糖苷在0.309～7.735μg范圍內的進樣量,與峰面積呈現良好的線性關系。

2.5.2 方法學考察 精密度試驗。取“2.2”項下供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,連續進樣6次,測得峰面積,并計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,3種成分的RSD值分別為1.03%、1.23%和1.16%,表明所用方法的精密度良好。

穩定性試驗。取“2.2”項下供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測,測得峰面積,并計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.00%、0.63%和1.11%,表明所用方法的穩定性良好。

重復性試驗。取藥材(S3)粉末約0.5g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液6份,并按“2.3”項下色譜條件測定峰面積,計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.70%、1.12%和1.71%,表明所用方法的重復性良好。

加樣回收率試驗。稱取同一藥材(S11)粉末6份,每份約0.1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入戟葉馬鞭草苷(0.628mg/mL)、馬鞭草苷(0.828mg/mL)及毛蕊花糖苷(0.518mg/mL)3種對照品溶液1mL,按“2.3”項下色譜條件測定峰面積,計算樣品中戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和測定量,3種指標性成分平均回收率分別為97.83%、98.67%和97.76%,其RSD值分別為0.89%、0.87%和1.18%,見表8。

表8 3種指標性成分的加樣回收率 (n=6)

2.5.3 含量測定 取藥材粉末0.5g,精密稱定,依照“2.2”項下方法制備供試品溶液并測定,按外標法計算樣品中各成分的含量,結果見表9。

表9 指標性成分含量測定結果 (%)

不同批次馬鞭草藥材中戟葉馬鞭草苷含量在0.32%～0.63%,馬鞭草苷含量在0.25%～1.89%,毛蕊花糖苷含量在0.26%～2.40%。研究結果表明,不同產地不同批次馬鞭草藥材中各成分含量差異明顯。

2.6 一測多評法測定藥材中3種指標性成分的含量

2.6.1 相對校正因子的計算 在線性范圍內,各成分的量與峰面積成正比關系,即W=fA,相對校正因子f(k/m)=fk/fm=(Wm×Ak)/(Wk×Am),其中Ak為內參物峰面積,Wk為內參物的質量或濃度,Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的質量或濃度。以馬鞭草苷為內參物,測定結果計算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.11,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.46,RSD分別為0.88%、2.68%,見表10。

表10 3種成分的相對校正因子

2.6.2 相對校正因子重復性考察 精密吸取混合對照品溶液2、4、10、20、50μL,在確定的色譜條件下進樣測定,計算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.15,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.44,RSD分別為2.69%、1.10%,結果顯示,各成分的f值重復性良好。

2.6.3 不同色譜儀和色譜柱考察 取對照品溶液,選擇Shimadzu LC-10A型和Agilent 1200型高效液相色譜儀,選定色譜柱Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)、Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm)進行色譜分析,計算f值。結果表明,不同高效液相和色譜柱對馬鞭草3種指標性成分f值的影響無明顯差異,見表11。

表11 儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.4 不同流速考察 同等色譜條件下,分別設定流速為0.8、0.9、1.0mL/min,取混合對照品溶液進樣測定,計算f值,RSD分別為0.53%、0.40%。表明流速對各成分f值的影響無明顯差異。

2.6.5 不同柱溫考察 在同等色譜條件下,分別設定柱溫為25、30、35℃,取混合對照品溶液進樣測定并計算f值,結果RSD為0.92%、0.40%。表明柱溫對各成分f值的影響無明顯差異。

2.6.6 待測成分色譜峰定位標準 以馬鞭草苷為內參物,定位標準設置為保留時間差和相對保留值。由表10、表11 結果可知,保留時間差波動較大,RSD>2%。相對保留值波動較小,RSD均<2%,無明顯差異。因此,選擇相對保留值作為最終定位標準,見表12。

表12 相對保留值考察結果

2.7 一測多評法與外標法的比較

取藥材粉末0.5g,制備供試品溶液進行測定,分別采用外標法和一測多評法計算各成分的含量。

由實驗結果可知,戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對馬鞭草苷的保留時間相對校正因子平均值分別為0.75、0.80。因此戟葉馬鞭草苷保留時間T1=0.75×ts,毛蕊花糖苷保留時間T2=0.80×ts,其中ts為馬鞭草苷的保留時間。戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對馬鞭草苷的相對校正因子為1.11和1.22。根據研究結果得出含量計算公式:

戟葉馬鞭草苷:lgCi=1.11×(lgCs×lgAi)/lgAs

毛蕊花糖苷:lgCi=1.22×(lgCs×lgAii)/lgAs

其中As為內標物馬鞭草苷的峰面積,Cs為內標物馬鞭草苷的濃度,Ai和Aii分別為戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷的實測峰面積。測定結果見表13。

表13 外標法和一測多評法測定3種指標性成分的含量 (%)

3 討論

建立馬鞭草指紋圖譜與主成分分析、聚類分析相結合的方法,可合理評價該藥材質量,為建立科學的馬鞭草藥材質量控制方法提供依據[10]。

一測多評法可作為中藥飲片、配方顆粒、中成藥等中藥制劑質量控制的有效手段[11]。本研究首次將一測多評法應用于馬鞭草藥材的質量評價體系中,具有快速、簡便、低成本等優點,可有效應對大量分離純化難度較高的化學對照品稀缺以及價格昂貴的局面,并提高檢測效率,對馬鞭草藥材的評價標準的完善具有重大意義,也將進一步推動一測多評法在藥材質量控制中的應用。

本研究通過建立馬鞭草指紋圖譜,同時運用一測多評法對16批馬鞭草中3種指標性成分進行含量測定,不同批次間戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷的含量差異不大。兩種方法測定結果無明顯差異,相對校正因子重復性良好。通過馬鞭草苷可實現對其余兩種指標性成分的定量分析,方法簡單準確,并且能節省大量對照品,經濟實用,具有一定的推廣價值。