相惡藥對對白鮮皮主要成分含量的影響

康靖杰,李欣然,賈天柱,夏林波,尹海波,陳曉霞

(遼寧中醫藥大學,遼寧 大連 116600)

中藥白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)是多年生草本植物蕓香科(Rutaceae)白鮮的根皮,主要分布于黑龍江、甘肅、新疆、安徽、朝鮮、蒙古和俄羅斯等[1]。漢代《神農本草經》首次記載了這種植物適應性強,喜歡溫暖潮濕的環境,但不喜積水[2],通常被用作傳統的醫藥治療濕疹、濕熱瘡毒、風疹、疥瘡、麻風病、風濕熱痹、黃疸紅尿等。傳統的中醫理論認為該藥具有熱、清、濕、燥、散風、解毒之功效,常用于治療蕁麻疹和其他疾病特應性皮炎。到目前為止,已有200多種化合物被提取并鑒定為白鮮皮中的生物堿、糖苷類、萜類及其衍生物[3,4]。其中,白鮮堿、黃柏酮和梣酮是白鮮皮的主要成分?，F代藥理學研究表明,白鮮堿具有抗真菌、強心、松弛血管、抗血小板聚集、抗皮膚光損害、抗癌等作用;梣酮具有抑菌、殺蟲、保肝降酶、抑制肝纖維化等生物活性;黃柏酮具有降血糖、抗癌等活性作用[5]。

相惡是中藥七情配伍的重要組成部分,其內涵在歷代本草中不盡相同。在歷代古本草醫籍中多從兩方面定義相惡:一種是藥物本身受到其他藥物制約;另一種是可制約其他藥物毒副作用[6]。作為中藥七情配伍之一,相惡最早見于漢代《神農本草經》:“勿用相反相惡者。”盡管相惡被視作配伍禁忌,然而歷代醫家使用相惡藥對同用的方劑卻不鮮見[7]。古籍《新修本草》和《名醫別錄》中均記載有白鮮惡桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢,其相惡的原理以及是否在配伍過程中影響白鮮皮主要化學成分含量,值得研究。因此,本實驗采用HPLC法對白鮮分別與桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢配伍后白鮮中三種主要化學成分白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量進行測定,并通過改變不同配伍比例探討與白鮮皮相惡的四種藥物對白鮮皮三種成分含量的影響規律,為揭示白鮮皮相惡原理提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 白鮮皮購于康美藥業股份有限公司,經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為四年生蕓香科植物白鮮的根皮;桑螵蛸(產地:山東)、茯苓(產地:湖北)、桔梗(產地:河北)、萆薢(產地:亳州)均購于遼寧省大連市海王星辰健康大藥房,經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定均為正品。白鮮堿對照品(純度≥98 %,江蘇永健醫藥科技有限公司,批號:YJ0102);黃柏酮(純度≥98%,中國食品藥品鑒定研究院,批號:111923-20160);梣酮對照品(純度均≥98%,中國食品藥品鑒定研究院,批號:111700-201603);甲醇(色譜純,天津科密歐有限公司)。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀(安捷倫公司,美國,型號:1260 Agilent型);十萬分之一電子天平(島津公司,日本,型號:AUW220D型);電熱恒溫水浴鍋(上海赫田科學儀器有限公司,型號:HH-M4型);小型粉碎機(溫州頂力醫療器械有限公司,型號:DFT-300型);超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ5200DE型);電熱鼓風干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司,型號:101-2A型)。

1.2 方法

1.2.1 白鮮皮單煎膏制備 稱取白鮮皮5.00g,加入12倍量的水煎煮1h;然后再加入10倍量的水煎煮1h,趁熱抽濾,蒸干;烘箱烘干成浸膏,計算浸膏率。

1.2.2 白鮮皮合煎膏制備 稱取白鮮皮5.00g,分別加入不同量的桑螵蛸、茯苓、桔?；蜉伤Z,配制成1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的藥對,按照單煎膏方法制備,計算浸膏率。

1.2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取白鮮堿、黃柏酮和梣酮對照品9.30、10.15、10.66mg,加甲醇依次定容至25、10、10mL容量瓶中,然后精密移取白鮮堿、黃柏酮和梣酮對照品溶液各0.75、1.25、0.5mL混合均勻,配制為混合對照品母液,低溫、避光保存。

1.2.4 供試品溶液的制備 依據單煎、合煎藥材所得浸膏率折合含白鮮皮生藥量為1.00g,稱取浸膏溶于25 mL無水甲醇中,濾過;13 000r離心10min,取上清,0.45μm微孔濾膜濾過,得白鮮皮單煎及不同配比合煎液供試品溶液,置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為C18;流動相為甲醇(A):水(B)(55∶45),流速為1.0mL/min;柱溫為40℃;進樣量為10μL;檢測波長為236nm;理論塔板數應≥5 000。

1.2.6 含量測定 取白鮮皮單煎樣品及不同配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)合煎樣品,按“1.4”項下色譜條件分別進樣,雙樣雙針,每份樣品測定2次,記錄峰面積,計算白鮮皮中白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量及RSD值。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線 精密移取一定量白鮮堿、黃柏酮和梣酮對照品儲備液混合均勻,將對照品溶液逐級稀釋2、4、10、20、40、100、200、400、1 000倍,取各混合對照品10μL按“1.2.5”項下色譜條件注入高效液相色譜中。以對照品溶液測得的峰面積為縱坐標(y),濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線,計算回歸方程。其線性考察結果,見表1。

表1 白鮮堿、黃柏酮和梣酮的線性方程線性范圍和相關系數

1.白鮮城 2.黃柏酮 3.梣酮

表2 白鮮堿、黃柏酮和梣酮的加樣回收率試驗結果

2.1.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL,按“1.2.5”項下色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積。結果白鮮堿、黃柏酮、梣酮的色譜峰峰面積RSD值分別為2.39%、2.98%、2.57%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性考察 取白鮮皮-茯苓(1∶1)供試品溶液,分別于 0、2、4、6、8、10、12、24、48h 按“1.2.5”項下色譜條件進樣測定,進樣量為10μL,記錄峰面積并計算RSD。48h 內白鮮堿、黃柏酮、梣酮色譜峰面積的RSD值依次為2.43%、3.21%、2.66%,表明供試品溶液在48h內穩定性良好。

2.1.4 重復性考察 取同一批藥材樣品白鮮皮-茯苓(1∶1),稱取6份,每份約1.0g,按“1.2.4”項下方法制備供試品溶液,在“1.2.5”項下色譜條件進樣10μL,進行測定,記錄白鮮堿、黃柏酮和梣酮峰面積的RSD值為1.43%、3.36%、1.03%,表明該方法重復性良好。

1.白鮮城 2.黃柏酮 3.梣酮

2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取白鮮皮-茯苓(1∶1)粉末6份,分別精密加入白鮮堿、黃柏酮和梣酮混合對照品溶液5、1、1mL,按供試品溶液方法制備,按“1.2.5”項下色譜條件進樣測定,計算回收率及RSD,結果見表 2。白鮮堿、黃柏酮、梣酮3個成分的平均加樣回收率及RSD均符合相關規定。

2.2 白鮮皮相惡藥對含量測定分析

白鮮皮單煎與合煎各組分成分溶出度測定結果比較:白鮮皮與萆薢或桑螵蛸合煎液中白鮮堿、黃柏酮、梣酮成分比單煎液中的含量明顯降低,但萆薢合煎液成分含量較后者更低;白鮮皮與茯苓或桔梗合煎液中,此3個成分含量較單煎液高?？芍柞r皮-萆薢或桑螵蛸配伍時降低了這3種成分總量的溶出;而與茯苓或桔梗配伍后較有利于成分的溶出。

在不同配伍配比的白鮮皮相惡藥對中,隨著白鮮皮-茯苓配伍比例的增加,白鮮堿、黃柏酮的含量隨之增多,梣酮的含量隨著茯苓比例的增加而減少;隨著白鮮堿-桔梗或萆薢配伍比例的增加,3種成分含量趨向于被抑制,但白鮮皮-桔梗不同配比對梣酮含量的影響并未表現出明顯的規律性;白鮮皮-桑螵蛸的不同配伍比例對白鮮堿、黃柏酮、梣酮含量影響較小。另外,白鮮皮-桑螵蛸藥對配伍比例為1∶1時,3種成分含量最高。結果見表3和圖3。

注:a.白鮮堿;b.黃柏酮;c.梣酮。

表3 樣品的含量測定結果

2.3 討論

經典的煎煮工藝多為水煎劑,提取的藥用成分也多為水溶性成分。基于此,采用水煎煮的方法來制備供試溶液,使其能最大程度地反映藥對的物質基礎[8]。在多組分含量測定中,還考察了不同溶劑(50%甲醇、無水甲醇、水等)對白鮮皮相惡藥對含量的影響。結果表明,以水作為溶劑時,藥物中白鮮堿的峰面積明顯減小,黃柏酮與梣酮幾乎沒有峰;當50%甲醇作為溶媒時,黃柏酮、梣酮在藥對中的峰面積增加。因為白鮮皮的化學成分大多不溶于水,是含有揮發油、檸檬苦素、黃酮類等易溶于有機溶劑的成分;隨著化學成分在白鮮皮中的溶出度降低,也間接影響其他藥物化學成分的溶出度。因此,無水甲醇最終被用作本研究的溶媒。為了更好地分離出白鮮皮相惡藥對中三種主要成分含量,建立了同時測定白鮮皮相惡藥對中三種成分含量的分析方法。該方法操作簡便、特異性好、結果準確可靠,為白鮮皮相惡藥對的多指標成分綜合評價提供了一種分析方法。結合配伍前后各組分含量的變化,可為白鮮皮藥對的臨床配伍和研究提供科學依據。

實驗顯示不同配伍比例的白鮮皮相惡藥對對白鮮皮中化學成分含量會產生影響。據文獻研究表明,茯苓作為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核,主要含有三萜類、多糖類、二萜類、甾醇類等成分[9]。桔梗有止咳平喘、抗炎抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、保肝等作用;在桔梗中發現的化學成分有三萜皂苷類、黃酮類、無機元素等成分[10]。據報道,黃柏酮、梣酮作為檸檬苦素類化合物在植物體內主要通過三萜類化合物合成的,其前體化合物一般認為是大戟烷型或甘遂烷型[11]。作為蕓香科植物的主要特征化學成分,根據其合成途徑推測,隨著茯苓或桔梗的加入,白鮮皮與其三萜類成分經過A 環開裂、D環再氧化開裂形成黃柏酮,通過成醚或成酯反應,A環和B環降解,D環開裂形成內酯生成降解型檸檬苦素類化合物梣酮;從而使其含量在各自組別中有所增加。萆薢作為一種常用中藥,含有甾體、二芳基庚烷、木脂素類、有機酸等多種化學成分,具有抗腫瘤、抗骨質疏松、抗真菌、抗心肌缺血、降尿酸、調血脂等作用[12]。白鮮皮與萆薢配伍后,可使白鮮堿含量降低,這可能與萆薢中有機酸與白鮮皮中的生物堿成分發生反應有關。而桑螵蛸除主要含有蛋白質、脂肪和糖類化合物外,還有其他一些有效成分[13],至于是何者產生相惡作用,相關報道太少,還需進一步探究。

3 結語

本研究建立HPLC法同時測定白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量,僅從成分含量的角度考察了不同配伍比例白鮮皮四組相惡藥對(桑螵蛸;茯苓;桔梗;萆薢)對白鮮皮中3種主要成分含量的影響,對其藥對化學成分變化并未考察,后續還需從藥效學等多個方面進一步研究,旨在為白鮮皮相惡藥對的研究提供更詳實的數據支持。