逐瘀清心膠囊對(duì)精神分裂癥大鼠神經(jīng)組織及髓鞘病變影響及機(jī)制

彭愛能,趙玉萍,趙永厚,于 明,柴劍波

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2. 黑龍江神志醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150036)

精神分裂癥是以情感、意識(shí)、思維障礙為主要表現(xiàn)的精神疾病,髓鞘結(jié)構(gòu)異常以及功能障礙參與了該病的發(fā)生發(fā)展[1]。中醫(yī)認(rèn)為精神分裂癥是由于先天稟賦不足或后天情志不暢,氣血失和,臟腑功能紊亂,氣、痰、瘀、火相互搏結(jié),阻滯清竅,腦神被擾,引起神志異常的疾病[2]。中醫(yī)對(duì)于精神分裂癥,尤其是恢復(fù)期精神分裂癥有較好的治療效果,可有效緩解患者焦慮、抑郁、認(rèn)知功能障礙等癥狀,且安全性較高[3]。瘀與火是精神分裂癥發(fā)病中重要的病理因素,逐瘀清心膠囊是針對(duì)精神分裂癥瘀熱互結(jié)的特點(diǎn)化裁而來,功專化瘀清熱、開竅醒神。本實(shí)驗(yàn)通過觀察精神分裂癥大鼠腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶中分化抑制因子2(Id2)、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子1(Olig1)、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(Olig2)蛋白表達(dá)情況,旨在明確逐瘀清心膠囊對(duì)精神分裂癥大鼠神經(jīng)組織及髓鞘病變的影響及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,8周齡,體重180～220 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,室溫22～26 ℃,濕度55%～60%,自然光線,自由飲食。

1.2藥品 逐瘀清心膠囊(主要成分為半夏、制南星、三棱、莪術(shù)、大黃、茵陳蒿等),黑龍江神志醫(yī)院院內(nèi)制劑,批號(hào):Z20100270,規(guī)格:0.40 g/粒;取逐瘀清心膠囊粉末加蒸餾水制備成混懸液, 生藥含量為0.054 g/mL。利培酮片,江蘇恩華藥業(yè),國(guó)藥準(zhǔn)字H20050160,規(guī)格:1 mg/片;取利培酮片研磨成粉末,加蒸餾水制備成混懸液,生藥含量為0.0 036 mg/mL。

1.3試劑與儀器 無水乙醇(HAC0057,天津永大),蘇木素(C0107,Beyotime),伊紅(C0105M,Beyotime),石蠟(39601095,Leica),勞克堅(jiān)牢藍(lán)(LFB,G3245,Solarbio),磷酸鹽緩沖液(PBS,MA0016,Meilunbio)。高壓蒸汽滅菌器(MLS-3751L-PC,Panasonic),純水系統(tǒng)(TANKPE0600,Millipore),顯微鏡(BX53,OLYMPUS),制冰機(jī)(IMS-50,雪科),脫水機(jī)(KD-TS3A,科迪),生物組織攤烤烘片機(jī)(KD-TI,科迪),輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(HistoCore MULTICUT,Leica),低溫離心機(jī)(SORVALL ST8/8R,Thermo),冷凍包埋機(jī)(KD-BMIII、BLIII,科迪)。

1.4分組、造模及給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、逐瘀清心組、利培酮組,每組10只。模型組、逐瘀清心組、利培酮組大鼠給予MK-801藥液0.1 mg/(kg·d)腹腔注射建立精神分裂癥模型,空白組給予等劑量生理鹽水腹腔注射,均1次/d,連續(xù)注射14 d。造模成功后,逐瘀清心組給予逐瘀清心膠囊混懸液0.054 g/(kg·d)灌胃,利培酮組給予利培酮混懸液0.036 mg/(kg·d)灌胃,空白組及模型組給予等量蒸餾水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃28 d。

1.5標(biāo)本采集 灌胃結(jié)束后,每組各取大鼠5只,用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,快速斷頭剝離取出大鼠完整腦組織,經(jīng)生理鹽水漂洗后放入冷凍管中,液氮速凍固定,-80 ℃冰箱保存,以備于Western blot檢測(cè);剩余各組大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,待進(jìn)入麻醉狀態(tài)后采用心臟灌流術(shù)灌流取腦,剝離腦組織后置于4%多聚甲醛固定液中,4 ℃固定48 h,將固定好的樣本脫水,石蠟包埋,切片,厚度為4 μm,以備于HE染色和LFB染色。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1腦組織病理形態(tài) 取上述石蠟切片脫蠟水化,蘇木素染色10 min,雙蒸水洗片2次,各1 min,分化液分化3 s,50 ℃溫水洗片3次,各5 min,伊紅染色30 s,各梯度乙醇、二甲苯脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.6.2腦白質(zhì)脫髓鞘病變情況 取上述石蠟切片脫蠟水化,加LFB染色液,室溫過夜,95%乙醇洗去多余浮色液,蒸餾水沖洗,Luxol分化液分化15 s,70%乙醇分化30 s,水洗,顯微鏡觀察,直至灰質(zhì)和白質(zhì)輪廓分明,用95%乙醇、100%乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.6.3腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶組織中Id2、Olig1、Olig2蛋白表達(dá)情況 Western blot法檢測(cè):取上述-80 ℃保存的腦組織,加入適量Complete RIPA Buffer制備組織勻漿液,4 ℃下13 000 r/min離心10 min,取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白溶液,加入5×Protein Loading Buffer,100 ℃金屬浴5 min,上樣,電泳,以濕轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,封閉液封閉2 h,將PVDF膜全部浸沒在稀釋的一抗中,4 ℃孵育過夜,1×TBST洗膜4次,每次15 min,將PVDF膜全部浸沒在稀釋的二抗中,室溫孵育1h,1×TBST洗膜4次,每次15 min,將膜浸于ECL發(fā)光液中,避光顯色2 min,置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布且方差齊,多組間比較采用單因素方差分析(one-way RANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腦組織病理形態(tài) HE染色顯示:空白組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,胞質(zhì)均勻,無明顯核固縮現(xiàn)象;模型組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核固縮或溶解現(xiàn)象明顯;與模型組比較,逐瘀清心組和利培酮組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核固縮或溶解現(xiàn)象減輕,細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則,僅見少量核固縮、核溶解現(xiàn)象;與利培酮組比較,逐瘀清心組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密,形態(tài)規(guī)則,核固縮、核溶解現(xiàn)象更少見,整體更趨近于正常。見圖1。

圖1 空白組和精神分裂癥各組大鼠腦組織病理形態(tài)(HE染色,×400)

2.2各組大鼠腦白質(zhì)脫髓鞘病變情況 LFB染色

顯示:空白組大鼠腦白質(zhì)髓鞘組織致密,分布規(guī)則,少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量正常;模型組大鼠腦白質(zhì)髓鞘組織稀疏,有明顯的染色斷裂,即神經(jīng)纖維表現(xiàn)出明顯脫髓鞘病變;與模型組比較,逐瘀清心組和利培酮組大鼠髓鞘結(jié)構(gòu)更加完整,排列規(guī)則,少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加;與利培酮組比較,逐瘀清心組少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量更多,髓鞘更完整,脫髓鞘病變進(jìn)一步減輕。見圖2。

圖2 空白組和精神分裂癥各組大鼠腦白質(zhì)脫髓鞘病變情況(LFB染色,×400)

2.3各組大鼠額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶組織中Id2、Olig1、Olig2蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶組織中Id2蛋白表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),逐瘀清心組和利培酮組上述各部位組織中Id2蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05);模型組大鼠腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶組織中Olig1和Olig2蛋白表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05),逐瘀清心組和利培酮組上述各部位組織中蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 空白組和精神分裂癥各組大鼠腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶組織中Id2、Olig1、Olig2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

精神分裂癥是最常見的精神疾病,該病所致殘疾人口約占總殘疾人口的3.75%,在所有的精神病性障礙中占比最高[4]。神經(jīng)發(fā)育障礙是精神分裂癥發(fā)生的重要機(jī)制之一,白質(zhì)異常和中間神經(jīng)元功能障礙是精神分裂癥患者最常見的細(xì)胞神經(jīng)病理學(xué)改變[5]。有研究表明,精神分裂癥患者的少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘完整性異于正常人[6]。Id2是神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的負(fù)調(diào)控因子,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,通常在神經(jīng)損傷后上調(diào),與神經(jīng)再生及修復(fù)有關(guān)[7]。一項(xiàng)關(guān)于坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn),Id2基因過表達(dá)可加速坐骨神經(jīng)擠壓后神經(jīng)軸突再生,促進(jìn)神經(jīng)損傷后神經(jīng)肌肉接頭的再支配,促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)及神經(jīng)肌肉功能恢復(fù)[8]。Olig1、Olig2屬于少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育分化。在神經(jīng)發(fā)育過程中,神經(jīng)前體細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞,Olig2因子影響早期前體細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程,從而對(duì)髓鞘發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。陳顯軍[10]研究發(fā)現(xiàn),Olig2基因敲除小鼠大腦皮質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良,并出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能缺陷、社交回避等精神分裂癥樣行為。Olig1在少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟后期和髓鞘形成過程中起關(guān)鍵作用,Olig1基因缺失的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟時(shí)間延遲[11]。

精神分裂癥中醫(yī)病名為“癲狂”,瘀與熱是癲狂病的重要病理因素,瘀久易化熱,瘀熱互結(jié),阻塞腦絡(luò),熱甚擾動(dòng)心神,使神志錯(cuò)亂。逐瘀清心膠囊主要成分為大黃、川芎、丹參、三棱、枳實(shí)、琥珀、生龍骨、生牡蠣,全方清熱活血、逐瘀通竅。組方中大黃瀉熱逐瘀,引熱下行排出體外;三棱、川芎活血行氣,枳實(shí)行氣,氣行推動(dòng)血行;琥珀、生龍骨、生牡蠣重鎮(zhèn)安神,滋陰潛陽;丹參活血祛瘀,清心除煩;全方活血清熱之力強(qiáng),佐以重鎮(zhèn)安神之品,使積聚日久的瘀熱之邪消散,腦絡(luò)通暢,陰陽歸位,神志安和,精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,大黃中大黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用,對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷有抑制作用[12]。川芎中活性成分川芎嗪可通過抑制一氧化氮、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β釋放,起到抑制神經(jīng)炎癥的作用;阿魏酸則可通過減少活性氧(ROS)生成及調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶(LDH)水平發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[13]。精神分裂癥患者血清膽堿酯酶活性常高于正常人,而丹參酮具有抑制膽堿酯酶活性的作用[14]。枳實(shí)中的枳實(shí)黃酮可降低6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ROS水平,具有抗神經(jīng)細(xì)胞損傷作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠存在明顯神經(jīng)損傷及腦白質(zhì)脫髓鞘病變,額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶中Id2蛋白表達(dá)上調(diào),Olig1、Olig2蛋白表達(dá)下調(diào);逐瘀清心組大鼠神經(jīng)損傷及腦白質(zhì)脫髓鞘病變均明顯減輕,額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶中Id2蛋白表達(dá)下調(diào),Olig1、Olig2蛋白表達(dá)上調(diào)。說明逐瘀清心膠囊可明顯減輕精神分裂癥大鼠神經(jīng)組織損傷,其機(jī)制可能與調(diào)控腦額葉皮質(zhì)、海馬、扣帶中Id2、Olig1、Olig2蛋白的表達(dá),從而修復(fù)腦白質(zhì)脫髓鞘病變有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。