香芹酚對心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響研究

夏 楊,董 暉

(武警北京總隊醫院,北京 100027)

《中國心血管健康與疾病報告》調查顯示,中國城鄉居民死亡的首要原因依然是心腦血管疾病,尤其是心肌梗死[1]。及時疏通血管,對缺血心肌進行再灌注是治療心肌梗死的有效手段,但會引發心肌再次受損,如何緩解心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是當下心血管領域重點關注的問題。香芹酚即5-異丙基-2-甲基苯酚,為唇形科植物提取出的單萜酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、保護血管、保護肝臟等多種藥理效應[2]。近年來國內外學者研究發現香芹酚可能通過降低氧化應激水平、抑制細胞凋亡、增強細胞自噬等多種途徑保護再灌注受損的心肌組織[3-7],但其具體機制仍不明確。本實驗從線粒體凋亡途徑入手,通過構建MIRI大鼠模型,探討香芹酚預處理的心肌保護作用及其相關機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SD大鼠48只,雌雄各半,體重(200 ± 20)g,由北京安凱毅博生物技術有限公司提供,生產許可證號:SCXK(京)2017-0006。飼于動物房屏蔽環境,溫度20～23 ℃,相對濕度60%～70%,明暗光照12 h∶12 h。所有動物相關操作規程均經武警北京總隊醫院動物倫理委員會批準認可。

1.2藥品和試劑 香芹酚(純度99%),美國Sigma-Aldrich公司產品,臨用前以1%二甲基亞砜(DMSO)配成濃度1%、0.5%的溶液作為高、低劑量。氯化硝基四氮唑藍(NBT)、碘化丙啶(PI),美國Amresco公司產品。線粒體細胞色素C(Cyt C)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒,美國R&D Systems公司產品。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)活性檢測試劑盒(熒光法),美國Clontech公司產品。Trizol試劑、反轉錄試劑盒及實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒,美國Applied Biosystems公司產品。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)及內參β-actin等引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。

1.3儀器設備 ECG-2360型十二導聯心電圖機,上海光電醫用電子儀器有限公司產品;DHX-500型動物人工呼吸機,北京金洋萬達科技有限公司產品;PT2500E型高速勻漿儀,瑞士Kinematica公司產品;CKX41型光學顯微鏡,日本Olympus公司產品;醫學圖像分析系統,北京環中睿馳科技公司產品;FACS101型流式細胞儀,美國Becton Dickinson公司產品;SpectraMax iD3型熒光酶標儀,美國Molecular Devices公司產品;Mx3000P型實時熒光定量PCR儀,美國Agilent 公司產品。

1.4實驗方法 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、香芹酚低劑量組、香芹酚高劑量組,每組12只。于造模術前1周開始,香芹酚低、高劑量組分別給予香芹酚溶液50 mg/kg和100 mg/kg腹腔注射,假手術組和模型組給予等體積1%二甲基亞砜腹腔注射,均1次/d,術前30 min再給藥1次。模型組和香芹酚低、高劑量組采用冠脈左前降支結扎術[8]構建MIRI模型:麻醉后的大鼠仰位固定于手術臺,連接動物呼吸機并監測心電圖;于胸骨左旁第3～4肋間開胸,剪開心包膜,暴露心臟,在左心耳下緣2 mm處進針,肺動脈圓錐旁出針,進針深度約1 mm,將6/0縫線與充氣球囊一同結扎左冠脈前降支,關胸;球囊充氣后,心電圖ST段呈明顯弓背抬高作為缺血成功的標志,持續45 min;抽空球囊,再灌注6 h,心電圖抬高的ST段下降50%以上作為再灌注成功的標志。假手術組大鼠開胸后只冠脈穿線但不結扎,其余操作同上。

1.5觀察指標及方法

1.5.1NBT染色法測定心肌梗死面積 再灌注結束后,每組隨機取6只大鼠,處死后剪取心臟,洗凈,去除心房及右室,置于-20 ℃冰凍30 min,沿長軸切成厚度約2 mm的薄片5片,浸于0.1% NBT溶液中,37 ℃下孵育30 min,并以10%福爾馬林固定24 h,正常心肌呈藍色,缺血未梗死心肌呈淺紅色,梗死心肌呈灰白色。顯微鏡下成像,導入圖像分析系統,測算梗死區面積(IA)、危險區面積(AAR)和心室總面積(LVA),計算IA/AAR、IA/LVA以評估心肌梗死情況。

1.5.2流式細胞術測定細胞凋亡率 每組取剩余6只大鼠,處死后剪取心臟,洗凈,于冠脈結扎線下方取部分心肌組織,剪碎后加PBS緩沖液充分研磨,收集細胞懸液,1 000 r/min低溫離心5 min,棄上清,用PBS緩沖液洗滌數次并重懸,獲得較純的心肌細胞,于光鏡下進行細胞計數,調整心肌細胞濃度約為1×106個/mL;將心肌細胞重懸于70%預冷的乙醇中低溫固定過夜,檢測前1 000 r/min低溫離心,用PBS緩沖液洗去乙醇,細胞沉淀用PI低溫避光染色30 min,上流式細胞儀檢測。

1.5.3ELISA法測定胞漿中Cyt C含量 取上述濃度約1×106個/mL的心肌細胞,重懸于預冷的裂解緩沖液中,冰浴5 min,10 000 r/min低溫離心5 min,收集上清(胞漿抽提物)。取已包被Cyt C單克隆抗體的96孔板,加入胞漿樣品與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶耦聯抗體,按試劑盒說明書操作,上酶標儀測定450 nm吸光度(OD)值,并計算樣品濃度。

1.5.4熒光法測定胞漿中Caspase-3和Caspase-9活性 取上述胞漿抽提物,植于96孔板,按試劑盒說明書加入反應試劑和熒光底物,陰性對照孔中加入Caspase抑制劑,37 ℃下避光孵育1 h,上熒光酶標儀(激發光波長400 nm,發射光波長505 nm)檢測,以熒光強度表示Caspase-3、Caspase-9活性。

1.5.5RT-qPCR法測定心肌組織中Bcl-2、Bax mRNA表達情況 每組于冠脈結扎線下方取部分心肌組織,凍存于-80 ℃液氮中;檢測前精密稱重,研磨成粉,經Trizol試劑法提取總RNA,后反轉錄為cDNA,繼而行RT-qPCR擴增(引物片段長度149～163 bp),獲取樣本基因Ct值后,以β-actin為內參照進行均一化處理,采用公式2- Ct計算樣本基因的相對表達量。Bcl-2上游引物序列為 5’-GTCACAGAGGGGCTACGA-3’,下游引物序列為5’-GTCCGGTTGCTCTCAGG -3’;Bax上游引物序列為5’-CGGCTGCTTGTCTGGAT-3’,下游引物序列為5’-TGGTGAGTGAGGCAGTGAG-3’;β-actin上游引物序列為5’-GTTGTGGCTCTGACATGCT-3’,下游引物序列為5’-CCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。

2 結 果

2.1各組心肌梗死面積比較 香芹酚低、高劑量組IA/AAR、IA/LVA均明顯低于模型組(P均<0.05),香芹酚低、高劑量組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 假手術組和心肌缺血再灌注各組大鼠心肌梗死面積比較

2.2各組心肌細胞凋亡率比較 假手術組、模型組、香芹酚低劑量組、香芹酚高劑量組細胞凋亡率分別為(0.59±0.20)%、(37.46±6.22)%、(27.18±4.03)%、(26.01±5.54)%,模型組細胞凋亡率均明顯高于其他組(P均<0.05),香芹酚高、低劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組胞漿Cyt C釋放量比較 假手術組、模型組、香芹酚低劑量組、香芹酚高劑量組胞漿Cyt C釋放量分別為(11.48 ± 1.75)ng/mg pro、(120.59 ± 10.63)ng/mg pro、(82.21 ± 12.14)ng/mg pro、(79.30 ± 13.35)ng/mg pro,模型組胞漿Cyt C釋放量均明顯高于其他組(P均<0.05),香芹酚高、低劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組胞漿中Caspase-3和Caspase-9活性比較 模型組心肌細胞胞漿中Caspase-3和Caspase-9活性均顯著高于其他組(P均<0.05),香芹酚高、低劑量組間Caspase-3和Caspase-9活性比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 假手術組和心肌缺血再灌注各組大鼠心肌細胞胞漿中Caspase活性比較

2.5各組心肌組織中凋亡相關基因mRNA表達量比較 模型組心肌組織中Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯低于其他組(P均<0.05),Bax mRNA相對表達量均明顯高于其他組(P均<0.05),香芹酚高、低劑量組間Bcl-2和Bax mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 假手術組和心肌缺血再灌注各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax mRNA相對表達量比較

3 討 論

MIRI所涉及的病理生理機制極為復雜,包括氧化應激、炎癥反應、能量代謝障礙、鈣超載等。近年來“細胞凋亡學說”受到重視,認為心肌細胞凋亡異常是MIRI過程中一種重要的病理機制[9]。生理條件下,細胞凋亡有助于維持細胞增殖和細胞死亡間的平衡;MIRI發生時,冠脈再灌注不僅給缺血心肌組織提供賴以生存的氧氣和葡萄糖,同時也為細胞凋亡提供了能量,此時凋亡可誘導過度的細胞死亡,導致不可逆的心肌損害,降低心功能。相關臨床研究發現,心肌梗死患者行再灌注治療時,再灌注時間越晚,心肌細胞凋亡現象越明顯[10]。動物實驗研究亦表明,MIRI大鼠心肌組織與正常大鼠比較,其凋亡細胞顯著增多,缺血再通區域以凋亡細胞為主[11];大鼠冠脈缺血6 h后的心肌細胞凋亡指數最高,凋亡關鍵蛋白Caspase-3、Caspase-9活性在缺血3 h開始升高,6 h達高峰[12]。本實驗采用冠脈結扎45 min再灌注6 h的方法建立MIRI動物模型,結果模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著增高,證實細胞凋亡參與MIRI過程。故探討如何有效抑制再灌注后的細胞凋亡,保護受損的心肌,對MIRI防治具有重要意義。

研究表明,某些藥物可通過激活機體自身保護機制或促使釋放內源性活性物質,增強損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受性,實現對MIRI的保護作用[13]。本實驗結果顯示,香芹酚高、低劑量組心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率均明顯低于模型組,提示香芹酚預處理可抑制心肌細胞凋亡,減輕 MIRI 過程中心肌損傷。

由線粒體啟動、受Bcl-2家族調控、Caspase-9直接參與的線粒體傳導途徑是重要的內源性凋亡通路。MIRI 發生時,心肌細胞線粒體膜通透性轉換孔由于受到多種應激因素如氧自由基、鈣超載等影響而異常開放,線粒體中Cyt C大量釋放到胞漿。一方面,Cyt C的釋放誘導位于胞漿的促凋亡因子Bax進入線粒體,促進凋亡反應;另一方面,Cyt C與Caspase-9結合成復合體,啟動Caspases級聯反應,最終激活凋亡執行因子Caspase-3而引發心肌細胞凋亡[14]。抗凋亡因子Bcl-2位于線粒體外膜,通過調節線粒體膜通透性轉換孔,減少Cyt C的釋放;還可與Bax結合成異源二聚體,抑制凋亡反應。既往實驗研究發現過表達Bcl-2可明顯阻抑MIRI大鼠心肌細胞凋亡[15]。本實驗中,模型組大鼠胞漿Cyt C釋放量、胞漿中Caspase-3和Caspase-9活性、心肌組織中Bax mRNA表達量均顯著上調,心肌組織中Bcl-2 mRNA表達量則顯著下調,提示冠脈缺血45 min再灌注6 h后,線粒體凋亡途徑被激活并參與了MIRI的病理進程;香芹酚低、高劑量組胞漿Cyt C釋放量、胞漿中Caspase-3和Caspase-9活性、心肌組織中Bax mRNA表達量均顯著下調,心肌組織中Bcl-2 mRNA表達量顯著上調,說明香芹酚預處理可抑制Cyt C由線粒體易位至胞漿的釋放量,可減少Caspase-3和Caspase-9的活化,其通過抑制線粒體凋亡途徑,減輕MIRI過程中的心肌細胞凋亡反應。

綜上,香芹酚預處理對MIRI的心肌保護作用與抑制線粒體凋亡途徑、減輕心肌細胞凋亡反應等有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。