中華獼猴桃根提取物增敏索拉非尼對H22肝癌小鼠移植瘤生長及TNF-α的影響

袁 媛,任東峰,陳曉泉,蔣 喆

(1. 陜西省腫瘤醫院,陜西 西安 710061;2. 榆林市第一醫院,陜西 榆林 718000)

肝細胞肝癌約占原發性肝癌的75%～85%,是世界范圍內常見的消化系統惡性腫瘤。慢性病毒性肝炎、長期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用黃曲霉毒素污染的食物、血吸蟲病等多種原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群高發,該病預后很差,發病率與死亡之比約為1∶0.9[1]。手術是治療肝細胞肝癌的重要手段,但僅有少數患者確診時具有手術或肝移植機會,且5年復發率高達50%～70%[2]。索拉非尼是最早用于肝細胞肝癌系統抗腫瘤治療的分子靶向藥物,大型、隨機對照的國際多中心臨床試驗研究表明該藥能夠延緩晚期腫瘤無進展生存期(PFS)、總生存期(OS)[3-4],因此從2007年以來,索拉非尼已經包括我國在內的全球180多個國家藥監部門批準用于一線治療無法手術切除或遠處轉移的肝細胞肝癌患者,并列入多國的肝癌臨床指南或專家共識。但該藥長期、單一口服不可避免地會出現高血壓、腹瀉、皮疹及低磷酸鹽血癥等不良反應,無法耐受者需要停藥,影響總體療效。因此,開發針對肝細胞肝癌轉移和復發的新型靶向藥物或聯合天然中草藥治療具有重要意義。獼猴桃根又名藤梨根、紅藤梨,是獼猴桃科獼猴桃屬植物,其具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、降糖等作用,對胃癌、結腸癌、肝癌、肺癌均有明顯的抗腫瘤作用,但其具體的作用機制尚不十分明確[5]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種促炎因子,腫瘤狀態下可誘導其高表達,參與腫瘤細胞擴增、增殖[6]。本實驗觀察了獼猴桃根提取物對H22肝癌小鼠移植瘤生長及TNF-α表達的影響,從炎癥反應角度探討獼猴桃根提取物的抗腫瘤療效與機制,旨在為臨床開發治療晚期肝細胞肝癌的新藥提供客觀依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康昆明種小鼠24只,雌雄各半,鼠齡6～7周,體重(22±2)g,購于西安市長安區斗門實驗動物養殖科技有限公司,動物合格證號:醫動字第20-005號。飼養于西安交通大學第一附屬醫院醫學轉化中心實驗室,飼養環境溫度(23±2)℃,相對濕度(50±5)%,通風動物房平臺特定病原體(SPF)環境,按實驗動物使用的“3R”原則給予動物人道關懷。

1.2實驗瘤株 H22肝癌腹水瘤瘤株,購自第四軍醫大學實驗動物中心,昆明小鼠腹腔內傳代。

1.3主要藥品及制備 野生中華獼猴桃根購自西安市中藥材市場,參照文獻[7]方法,取50 g磨成粉,懸浮于10倍體積的雙蒸餾水中,加熱至100 ℃ 1 h,然后將湯劑過濾,整個提取過程重復2次,收集提取物(濃度200 μg/mL ),4～8 ℃冷藏備用。甲苯磺酸索拉菲尼片(Sorafenib德國拜耳先靈醫藥,國藥準字H20110599,規格:0.2 g/片),按照成人40 mg/kg換算小鼠給藥劑量[8],將索拉非尼200 mg加入蒸餾水100 mL配制成混懸液,即每 0.5 mL含有1 mg索拉非尼。

1.4主要儀器 光學顯微鏡(廣西梧州市光學儀器廠),水平離心機(LD-42型,北京醫用離心機廠),超凈工作臺(蘇州凈化設備廠),精密電子稱(上海第二分析儀器廠),電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司),電子天平(上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠),微量移動液器、冰箱 (西安交通大學第一附屬醫院醫學轉化中心實驗室提供),活體熒光影像系統(I.C.E．,日本Roper公司)。

1.5實驗方法 將腹腔內傳代H22肝癌瘤株的小鼠脫頸椎處死,浸泡于95%乙醇中5 min,在超凈工作臺無菌條件下抽取瘤液(呈淡奶白色),置于離心機內1 500 r/min離心2 min,棄去上層淡色較清亮腹水,保留下層較濃稠呈稀糊樣的半液態物,用新鮮配制的0.02%臺盼藍染色,混勻后在血細胞計數盤上計數,染色者為死細胞,不染色者為活細胞,計算活細胞數,用生理鹽水調整細胞濃度至2.0×106/mL,然后用0.5 mL注射器,以0.2 mL/只接種于24只小鼠腹腔皮下,制作成移植瘤模型。將24只造模成功的小鼠按隨機數字表分為4組,每組6只。 肝癌組給予生理鹽水灌胃,獼猴桃根提取物組給予中華獼猴桃根提取物灌胃,索拉非尼組給予索拉非尼灌胃,聯合組給予中華獼猴桃根提取物和索拉非尼灌胃,前3組均于每天9:00灌胃,聯合組的索拉非尼在每天15:00灌胃,灌胃量均為0.5 mL/只,1次/d,連續灌胃15 d。灌胃結束后次日處死。

1.6檢測指標及方法

1.6.1小鼠機體狀態 每日觀察小鼠的自主活動、精神狀態、毛發、呼吸、飲食、糞便性狀及對外界刺激的反應。

1.6.2小鼠移植瘤生長情況 熒光素酶標記各組小鼠移植瘤生長情況,分別在瘤移植的第0,5,10,15天于小鼠腹腔注射熒光素底物(1.5 mg/10 g),飽和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統攝像,Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.6.3瘤重及抑瘤率 灌胃結束后次日處死小鼠,用鑷子鑷住腹腔腫瘤生長部位皮膚后用手術剪剪開皮膚,暴露腫瘤,去除血污,用手術剪鈍性剝離腫瘤,稱瘤重,計算抑瘤率。抑瘤率(%)=[1-(平均用藥組瘤重/平均對照組瘤重)]×100%。

1.6.4TNF-α表達情況 采用免疫組化染色法檢測:移植瘤經10%多聚甲醛固定,梯度脫水,石蠟包埋后5～7 μm連續切片,撈片后置60 ℃烤箱60 min使切片緊密黏附,石蠟水化,PBS洗滌,30% H2O2溶液室溫作用10 min去內源酶活性;浸入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中,微波抗原修復10 min;自然冷卻后加蒸餾水洗2 min,3次;加入兔抗小鼠TNF-α單抗(1∶80),4 ℃冰箱過夜;PBS洗滌后,加入生物素化小鼠IgG室溫孵育20 min;PBS液洗滌3次后,滴加試劑SABC,室溫孵育20 min,PBS液洗滌5 min,4次;取1 mL蒸餾水,加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應時間,蒸餾水洗滌;蘇木素復染,脫水,透明,中性樹膠封片。陽性片作為陽性對照,用PBS液代替一抗作為陰性對照,熒光顯微鏡下觀察、拍照,以上所有指標檢測均嚴格按照試劑盒操作說明進行。TNF-α主要表達在胞漿,陽性染色呈棕黑色顆粒。高倍鏡下取4個不同視野各計數200個細胞,按陽性細胞數所占的百分比進行定量,用計算機圖像分析系統(江蘇捷達形態學分析軟件JEDA801D)計算陽性表達率。

2 結 果

2.1各組小鼠機體狀態 實驗過程中各組未出現死亡現象,聯合組和索拉非尼組進食狀況均良好,未見腹瀉,活動正常,體重增加,對刺激反應靈敏,毛色光亮。獼猴桃根提取物組進食欠加,未見腹瀉,活動正常,體重增加不明顯,對刺激反應欠靈敏,毛色欠光滑;肝癌組出現厭食,腹瀉,體重減輕,精神萎靡,對刺激反應遲鈍,毛色灰暗。

2.2各組小鼠移植瘤生長情況 在光子數3×104～2×106范圍內,肝癌組和獼猴桃根提取物組發光強度隨移植瘤增長逐漸增強,索拉非尼組和聯合組發光強度變化不明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠肝癌細胞移植后第0,5,10,15天熒光素酶標記影像表現

2.3各組小鼠出瘤時間比較 肝癌組、獼猴桃根提取物組、索拉非尼組、聯合組小鼠出瘤時間分別為(4.7±1.3)d、(5.7±1.3)d、(7.1±1.2)d、(8.2±0.8)d,索拉非尼組、聯合組小鼠出瘤時間均明顯長于肝癌組(P均<0.05),聯合組小鼠出瘤時間明顯長于索拉非尼組(P<0.05),肝癌組與獼猴桃根提取物組出瘤時間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組小鼠瘤重、抑瘤率比較 獼猴桃根提取物組、索拉非尼組、聯合組瘤重均明顯低于肝癌組(P均<0.05);索拉非尼組、聯合組瘤重均明顯低于獼猴桃根提取物組(P均<0.05),抑瘤率均明顯高于獼猴桃根提取物組(P均<0.05);聯合組瘤重明顯低于索拉非尼組(P<0.05),抑瘤率明顯高于索拉非尼組(P<0.05)。見表1。

表1 各組肝癌小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.5各組小鼠瘤組織中TNF-α表達情況 肝癌組TNF-α表達增多,陽性表達率為(70.35±7.73)%;獼猴桃根提取物組、索拉非尼組、聯合組TNF-α表達減少,陽性表達率分別為(53.68±6.22)%、(48.21±4.36)%、(43.21±4.53)%,均明顯低于肝癌組(P均<0.05),且索拉非尼組、聯合組均明顯低于獼猴桃根提取物組(P均<0.05),聯合組明顯低于索拉非尼組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組肝癌小鼠瘤組織中TNF-α陽性表達情況(免疫組化染色,×200)

3 討 論

肝細胞肝癌發病機制尚不明確,其病理生理過程可能與多種基因突變、新生血管異常增生、細胞信號傳導通路改變等有關[9]。由于肝細胞肝癌易發生早期播散和轉移,且很大一部分為多中心發生,加之患者多伴有嚴重肝硬化,因此手術切除存在很大局限性。索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑,對于中晚期肝癌患者可延長生存時間2～3個月,單藥口服客觀緩解率低[10-11],聯合治療是近年臨床積極探索的治療方案。

現代中醫藥是腫瘤綜合治療的重要組成部分,以中醫藥理論為指導,辨證論治,與現代醫學技術有機結合,可恢復機體動態平衡,改善晚期腫瘤患者的生活質量,延長帶瘤生存期。中華獼猴桃根能清熱解毒、活血消腫,其主要含三萜類、酚類、蒽醌類、黃酮類、揮發油和糖及糖苷類等化合物[12],其氯仿提取物可抑制喉癌HEP-2細胞增殖。本實驗結果顯示,索拉非尼組、聯合組小鼠出瘤時間均明顯長于肝癌組,抑瘤率均明顯高于獼猴桃根提取物組;與索拉非尼組比較,聯合組小鼠出瘤時間明顯延長,抑瘤率更高。提示索拉非尼基礎上聯合中華獼猴桃提取物干預抑制H22肝癌小鼠腫瘤生長作用更明顯。

TNF-α是一種多向性的促炎癥反應細胞因子,由多種細胞分泌,正常生理狀態下低表達,有助于增強機體免疫力[14];當機體處于腫瘤等病理狀態時,可誘導其高表達,激活細胞級聯效應,導致機體炎癥反應加劇,造成多種病理性損傷,導致或加劇腫瘤細胞增殖[15-16]。本研究中,肝癌組瘤組織中TNF-α陽性表達率均明顯高于獼猴桃根提取物組、索拉非尼組、聯合組,其中聯合組TNF-α陽性表達率明顯低于獼猴桃根提取物組和索拉非尼組。提示獼猴桃根提取物能夠增敏索拉非尼作用,可以通過降低腫瘤胞漿中TNF-α的表達,抑制炎癥反應,控制腫瘤細胞增殖。

綜上所述,中華獼猴桃提取物具有增敏索拉非尼抗肝癌細胞作用,機制可能與下調TNF-α在瘤細胞胞漿中的表達,抑制炎癥反應,從而抑制腫瘤細胞增殖有關,但其涉及的信號通路尚不明確,有待進一步探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。