QuEChERS-GC/MS聯用技術測定羊雜碎中的N-二甲基亞硝胺

孫小龍，徐懷德，米林鋒，毛敏，樊慧華，侯磊磊

1. 榆林市食品檢驗檢測中心（榆林 719000）；2. 西北農林科技大學食品科學與工程學院（楊凌 712100）

近年來，研究得知亞硝胺類化合物（nitrosamines，NAms）是一種很強的化學致癌物質，廣泛存在于肉質類食物、化妝品、啤酒、香煙等食品中，而通常在腌制肉的制作工藝中N-二甲基亞硝胺是由蛋白質分解產物二甲胺在與亞硝酸鹽經過系列反應生成[1-2]，是一種強致癌物質，一般表現急性中毒癥狀，長期食用會導致肝硬化，腎臟衰竭。腌制肉和醬鹵肉多含有N-亞硝胺[3-5]，其中又以N-二甲基亞硝胺檢出率最高[6]。GB 2762——2017《食品中污染物限量》中規定水產品中N-二甲基亞硝胺的限量值為4 μg/kg[7]，另一方面由于腌制肉制品中含量較低，且樣品基質復雜，準確檢測亞硝胺類化合物難度較大，因此建立快速、高效檢測N-二甲基亞硝胺檢測方法，對監控食品安全和保障消費者健康有極其重要意義[8]。

榆林羊雜碎是陜北傳統小吃的典型代表，有著渾厚的飲食文化底蘊，更有廣泛的美食影響力，制作工藝上以羊肉湯料為主，添加薯條、豆條、粉條、香菜、調味料等多種食材，講究食材多樣，即食色香味滋形俱全，具有典型的地域飲食特征，包含了地方飲食的特色標簽。國內對亞硝胺類物質檢測主要有氣相色譜法[10-11]、氣相色譜-質譜法[12-13]、氣相色譜-串聯質譜法[14-15]及液相色譜-串聯質譜法[16-22]等，而對于羊雜碎中N-二甲基亞硝胺檢測則鮮有文獻報道，針對榆林市特色食品羊雜碎中N-二甲基亞硝胺污染物通過采用QuEChERS-氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），對比水蒸氣蒸餾-GC-MS聯用法建立測定羊雜碎中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的快速高效檢測方法，該方法簡單、快速，凈化效果好，靈敏度更高，以期為當地特色食品羊雜碎中N-亞硝胺類化合物的分析測試研究提供試驗依據，積極探索滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊雜碎樣品（生產企業送檢樣品）；氯化鈉（中國醫藥集團有限公司）；無水硫酸鎂（MgSO4-5H2O，密歐化學試劑有限公司）；乙酸、乙腈、二氯甲烷和正己烷（中國醫藥集團有限公司）；NDMA標準品（純度99.8%，TGI公司）；PSA、C18（Agela Technologies）；DPC復合凈化柱、GCB（北京DIKMA公司）。

1.2 儀器與設備

串聯質譜儀（7890B-7000C，安捷倫）；分析天平（ME204，梅特勒）；多功能振蕩器（HY-4）；均質器（HBM-400B）；全自動平行濃縮儀（MV-5）；智能水蒸氣蒸餾儀（ST106-1RW+STER02）；渦旋振蕩器（MS-3型）；樣品粉碎機（FW-200）；實驗室用水（經Milli-Q凈化超純水）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

NDMA標準品用二氯甲烷配制成5.0 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冰箱避光保存，用不含NDMA羊雜碎處理后的基質溶液將儲備液別稀釋至20，50，100，200，500和1 000 ng/mL標準工作液，避光保存。1%乙酸-乙腈提取溶液：取500 mL乙腈，加入冰乙酸5 mL，搖勻。

1.3.2 儀器分析參數

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氮氣；進樣口溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃保持1 min；色譜柱流量1.2 mL/min；進樣量1 μL；檢測器溫度280 ℃；不分流進樣。

1.3.2.2 質譜條件

離子源溫度230 ℃，輔助加熱器230 ℃。監測測模式：選擇離子模式監測（SIM），定性定量監測離子42/43/44/74。

1.3.3 試樣方法

1.3.3.1 QuEChERS前處理

隨機選擇企業送檢包裝羊雜碎樣品，切碎混勻，用均質器成勻漿，稱取20 g樣品加入10.0 mL乙腈（含有1%冰乙酸），渦旋振蕩2 min加入無水MgSO4和氯化鈉，渦旋振蕩2 min，按6 000 r/min離心5 min后，吸取5 mL上層清液，加入復合凈化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）凈化，收集凈化液，在5 000 r/min轉速下再離心5 min后，氮吹至近干，乙腈定容至1.0 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，上機測樣。

1.3.3.2 水蒸氣蒸餾法前處理

參考GB 5009.26——2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》羊雜碎樣品粉碎均勻后稱取200 g于1 L蒸餾瓶中，分別加入100 mL水和50 g氯化鈉于樣品瓶中，加入10粒玻璃球，連接全自動水蒸氣蒸餾儀蒸餾，放入冰水浴中，收集液管沒入二氯甲烷液面以下。開啟蒸餾裝置，收集冷凝液，冷凝液液面上升至400 mL位置后，關閉加熱裝置，停止蒸餾。蒸餾餾出液加入20 g氯化鈉和3 mL硫酸，攪拌至完全溶解，移至500 mL分液漏斗，轉移下層液，二氯甲烷多次提取，合并下層液。用10 g無水硫酸鈉將將萃取液脫水后，旋轉蒸發，采取40 ℃水浴濃縮方式濃縮至5 mL，定容至2.0 mL，上機分析。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇

對比不同極性色譜柱如非極性柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、中等極性柱DB-35（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、強極性柱DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對NDMA分離的影響。結果表明：選用非極性柱HP-5MS時，NDMA色譜峰受溶劑峰影響大，且有色譜峰展寬的現象，存在明顯拖尾現象；中等極性柱DB-35測定時，峰展寬現象明顯；選用強極性柱DB-WAXETR時，色譜峰尖銳，分離度好。因為亞硝胺分子結構具有強極性和強揮發性，強極性柱DB-WAXETR測定NDMA實現較好的很分離效果。因此選用DB-WAXETR作為色譜柱。

2.2 萃取率比較

分析3種樣品前處理過程對NDMA萃取效率的影響，試驗采用加標回收率對不同前處理萃取效率進行評價，分別以加標水平0.5，1.0，2.0和4.0 μg/kg計算2種前處理方式的萃取率水平，按式（1）計算。

式中：CS為NDMA實際檢測含量，μg/kg；CA為空白樣品中NDMA含量，μg/kg；Ca為NDMA添加量，μg/kg。

結果表明（圖1），羊雜碎中不同加標含量NDMA在2種前處理過程回收率差別明顯，QuEChERS前處理NDMA回收率在67.5%～87.5%之間，而采用水蒸氣蒸餾法處理樣品NDMA回收率在60.2%～80.9%之間，說明羊雜碎樣品經水蒸氣蒸餾提取過程NDMA損失相對較多，回收率相較QuEChERS前處理較低，因此試驗前處理選用QuEChERS方法。

圖1 不同前處理過程對NDMA萃取效率的影響

2.3 樣品前處理條件優化

GB 5009.26——2016檢測方法中水蒸氣蒸餾法操作繁瑣，稱樣量較大，耗時長，適用性不強，蒸餾過程操作溫度高，萃取過程大量使用二氯甲烷等有機試劑，易使被測物質亞硝胺損失。張偉偉等[21]采用水蒸氣蒸餾法提取食品中N-二甲基亞硝胺，經二氯甲烷提取，樣品添加回收率在84.5%～101%之間，而QuEChERS前處理方便快捷，又可避免上述水蒸氣操作弊端，因此采用QuEChERS對樣品進行前處理。

2.3.1 提取溶劑優化

研究表明試驗過程中提取溶劑極性不同會對NDMA含量的檢測產生較大影響，因此在羊雜碎樣品前處理過程選擇合適的提取溶劑。將二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯和乙腈（1%乙酸）作為提取溶劑進行提取效率比價，結果表明（圖2）：正己烷、二氯甲烷對目標物質的提取率一般，平均回收率為72.1%；由于正己烷和二氯甲烷為親油性，但極性相較乙酸乙酯和乙腈偏弱，同時乙酸乙酯為親油性同時有一定的親水性，對NDMA提取效果好于上述兩種提取溶劑，且回收率均較高，但提取的雜質較多，極易溶解大分子物質如蛋白和油脂類等物質，圖譜上雜峰較多，干擾較為明顯，由于NDMA含有胺基結構，屬于親核型化合物，所以在萃取體系中加入一定比例乙酸有利于目標物萃取，同時1%乙酸的加入掩蔽了色譜系統的活性，峰形和響應明顯提高。因此試驗采用（1%乙酸）乙腈作為檢測羊雜碎NDMA的提取溶劑，50ng/mL NDMATIC圖見圖3，50ng/mLNDMA特征離子圖見圖4，NDMA特征離子豐度圖見圖5。

圖2 不同提取溶劑對NDMA回收率的影響

圖3 NDMA TIC圖（50 ng/mL）

圖4 NDMA特征離子圖（50 ng/mL）

圖5 NDMA特征離子豐度圖

2.3.2 鹽析和脫水劑的選擇

由于提取溶劑乙腈微溶于水，因此該提取液中體系存在少量水分導致后期分離難等問題，通過對比MgSO4和NaCl不同配比（4∶1，3∶2，2∶3和1∶4，W/W）對NDMA提取效率高低的影響，圖6表明，無水MgSO4和NaCl添加量配比4∶1（W/W）時分離效果更好，NDMA回收率達79.3%，明顯高于其他MgSO4和NaCl例比，說明該配比NaCl通過鹽析分層作用使得水溶性雜質降低，避免提取液中干擾基質對檢測結果的影響，同時無水MgSO4可較快除去提取溶劑中的水分及鹽析后的水相層，因此本試驗鹽析過程采用4 g無水MgSO4和1 g NaCl添加量。

圖6 不同MgSO4和NaCl配比對NDMA萃取效率的影響2.3.3 吸附和凈化劑的選擇

羊雜碎以羊雜為主料，湯料中富含脂肪、蛋白等干擾物質，不同的吸附和凈化劑會對NDMA含量的檢測產生較大影響。而QuEChERS方法常用的吸附劑為C18、PSA、GCB等，其中大多用于植物源性食品，對于含油脂較高樣品去除能力一般，試驗對比C18、PSA、GCB及復合凈化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）除油脂的效果，由于DPC特殊結構對脂質中C5及以上的碳鏈具有非常強的選擇吸附性，既可以除掉基質干擾物的同時也不會吸附目標物而造成檢測結果的偏差。對比發現DPC相較PSA和C18等吸附劑去除油脂效果較好。同時，針對羊雜碎中油脂較多的特點，為進一步去除樣品中的油脂，試驗前采用在-20 ℃冰箱冷凍提前冷凍1 h。試驗對4種固相萃取柱C18、PSA、GCB及復合凈化小柱DPC的凈化效果進行比較。通過樣品加標試驗，比較每種萃取柱分別對NDMA回收率以確定最佳的固相萃取柱。由表1可知，DPC的凈化效果最好，回收率可達85.6%。這是因為羊雜碎中尤其是湯料羊雜中含有大量油脂和脂肪酸，DPC對于脂質中C5及以上的碳鏈吸附性較強，去除油脂和脂肪酸效果較好，因此試驗采用迪馬公司的混合吸附劑DPC對樣品進行凈化。

表1 種固相萃取小柱凈化效果比較

2.4 基質效應（matrix effect，ME）影響

檢測過程由于樣品基質、前處理過程、色譜分離效果等差異影響，檢測中產生對待測化合物離子增強或抑制的基質效應，進而嚴重影響定量結果的準確性。GC-MS/MS為減弱待測目標物基質效應的影響，主要解決方法主要為通過向不含待測物即陰性樣品處理液中添加待測物與接近濃度標準溶液響應作為對比，確定較為準確的檢測范圍，盡量避免檢測過程中基質效應對于檢測結果準確性影響[23]，由于試驗前處理采用QuEChERS方法簡單高效，因此試驗采用基質匹配標準液做校準曲線消除基質效應干擾，利用相對響應值法，根據入式（2）計算羊雜碎NDMA中的ME。

式中：ME為基質效應；Ac為某一濃度水平空白基質標準吸光度；Am為純溶劑標準吸光度。

考察羊雜碎不同濃度下NDMA基質效應的強弱，按1.3.4.1方法進行前處理并配制質量濃度20，50，

100，200和500 ng/mL的NDMA純溶劑標準溶液和空白羊雜碎基質匹配標準溶液，通過測定NDMA在上述2種溶液的響應值比較，若二者響應比值ME大于115%則表現較明顯的基質增強效應，若ME小于85%則基質抑制效應明顯，ME介于85%～115%則無基質效應。圖7表明，羊雜碎中NDMA測定過程存在明顯的基質效應干擾，濃度越小，羊雜碎基質中NDMA表現為基質增強效應，質量濃度100 ng/mL時，ME為109.3%，且隨著濃度的增加，基質效應逐漸減弱，NDMA質量濃度達到200 ng/mL以上時，不表現基質效應。說明羊雜碎中不同濃度NDMA在同基質中具有不同的基質效應表現，同時也表明基質效應與濃度具有一定關系，隨著濃度的增加，羊雜碎中NDMA基質效應逐漸減弱。因此采用基質標準曲線校準能減小基質效應對檢測結果的影響。

圖7 羊雜碎基質中不同濃度NDMA基質效應比較

2.5 方法評價

2.5.1 線性范圍及檢出限

稱取6份空白羊雜碎樣品，按照上述方法處理，用20，50，100，200，500和1 000 ng/mL質量濃度的空白羊雜碎樣品基質標準溶液為基準，線性方程及相關系數見表2。以信噪比為（rSN=3或10）分別計算檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），見圖8和表2。

表2 羊雜碎中NDMA回歸方程、相關系數、線性范圍和定量限

圖8 羊雜碎中NDMA回歸方程、相關系數

2.5.2 回收率及精密度

隨機選擇羊雜碎樣品，在1.0，2.0和5.0 μg/kg 3個水平下進行加標回收試驗，回收率范圍為78.6%～89.0%，見表3。

表3 羊雜碎中NDMA不同添加水平下回收率和精密度結果

2.6 樣品測定

采用所建立的方法對企業送檢16個羊雜碎樣品進行檢測，在所有樣品中均檢出NDMA殘留，含量為0.94～8.36 μg/kg，表明榆林市羊雜碎中在存在NDMA殘留，但含量基本小于限量要求。該檢測方法可滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測需求。

3 結論

采用QuEChERS-GC-MS聯用法建立測定榆林特色食品羊雜碎中NDMA的快速高效檢測方法。該方法簡單、快速，凈化效果好，靈敏更高度，可滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測需求，也為監管部門對于羊雜碎中亞硝胺類污染物檢測提供有力技術支撐，具有一定實際應用價值。