無齒E3泛素蛋白連接酶同源物在食管鱗狀細胞癌中的表達及與預后的關系△

楊彥娥，任佳欣，程彩霞#

山西醫科大學1公共衛生學院，2第一臨床醫學院，太原 048000

食管癌（esophageal cancer，ESCA）是常見的惡性腫瘤之一，2020年全球癌癥統計結果顯示，全球ESCA 新發病例達60.4 萬，死亡病例達54.4萬[1]。中國是ESCA 的高發國家，占全球一半以上，且以食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主[2]。目前，多數ESCA患者確診時已是晚期，且其發生發展伴隨著復雜的分子機制，使得多數患者的治療效果不容樂觀，術后5年總生存率不足15%[3-4]。隨著精準醫療和靶向治療的發展，靶向免疫細胞或腫瘤細胞的新療法為ESCA 患者帶來了希望。但由于ESCA 的分子分型仍不明確，缺乏特異性預后標志物，故可應用于臨床的靶向藥物極少。迄今為止，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）僅批準了3 種針對ESCA 的靶向治療藥物[5]。雖然靶向藥物改善了治療效果，但其缺點仍然需要解決。例如，靶向治療不僅比傳統的放療和化療昂貴，且易引起耐藥反應[6]。因此，挖掘新的ESCA 靶向治療分子標志物，優化ESCA 的治療仍是當務之急，尤其為晚期患者的治療增加新的選擇。無齒E3 泛素蛋白連接酶同源物（denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL，又稱CDT2）包含多個WD40 重復結構域，在調控DNA 復制和損傷中起著至關重要的作用[7]。此外，有學者報道，泛素特異性肽酶46（ubiquitin specific peptidase 46，USP46）蛋白可介導DTL 的穩定性，促進人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陽性腫瘤的生長，提示DTL 在腫瘤生長中具有潛在作用[8]。在ESCA 的研究中，Li 等[9]整合多個ESCA 數據集的表達譜發現，DTL 在ESCA 中表達上調，但沒有進一步實驗驗證且沒有對DTL 表達對ESCA 患者預后的影響進行分析。故本研究通過分析在線數據庫和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色結果，探討DTL在ESCC 組織和正常食管組織中的差異表達及其對患者預后的影響，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 資料收集

TIMER2 數據庫（http://timer.cistrome.org/）是一個可系統分析不同腫瘤類型中基因表達水平和免疫浸潤水平的數據庫[10]。從TIMER2 數據庫下載數據用來分析ESCA 組織和正常食管組織中DTLmRNA 表達的差異。

1.2 研究對象

選取2013年1月至2016年9月在山西醫科大學第一臨床醫學院接受手術治療的95 例ESCC 患者為研究對象。納入標準：①術前未接受過放化療；②臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并臟器功能異常；③失訪。95 例ESCC患者中，男性57 例，女性38 例；年齡＜60 歲45例，≥60 歲50 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期41 例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.3 免疫組化方法及評價標準

按照標準免疫組化實驗步驟檢測DTL 蛋白表達情況。先將ESCC 組織和癌旁正常組織制備成3 mm 石蠟切片，并與稀釋濃度為1∶200 的兔多克隆抗體DTL 在37 ℃暖箱中孵育1 h。接著在37 ℃下與酶標山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物二級抗體偶聯20 min，然后將每個切片用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑染色，最后用蘇木精復染。免疫組化結果由兩位高年資病理科醫師分別判定，當存在異議時由第三位高年資醫師判讀，并由三者商議后決定最終結果。于40 倍光學顯微鏡下隨機取5 個視野，每個視野至少計數100 個細胞。陽性細胞百分比評分：≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，＞75%為4 分。染色強度評分：無染色為0分，淡黃色顆粒為1 分，黃色顆粒為2 分，棕黃色顆粒為3 分。陽性細胞百分比評分與染色強度評分的乘積為最終結果，其中＜5 分為陰性表達，≥5 分為陽性表達。

1.4 隨訪

隨訪截止日期為2022年6月，對患者本人或家屬進行電話隨訪，詢問患者的生存狀態，記錄生存時間。本研究中的總生存期（overall survival，OS）定義為首次手術到因任何原因死亡或隨訪結束的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗；影響因素分析采用單因素及多因素Cox 比例風險回歸模型；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DTL mRNA 表達水平的比較

TIMER2 數據庫分析結果顯示，ESCA 組織中DTLmRNA 表達水平高于正常食管組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 ESCA組織和正常食管組織中DTL mRNA表達水平的比較

2.2 DTL 蛋白表達情況的比較

為了驗證上述數據的準確性，本研究采用IHC 檢測95 例ESCC 組織和癌旁正常組織中DTL蛋白表達情況。結果顯示，DTL 蛋白在ESCC 組織和癌旁正常組織的細胞核中表達，表現為彌漫性或散在的黃色或棕黃色顆粒。ESCC 組織中DTL 陽性表達率為56.8%（54/95），明顯高于癌旁正常組織的35.8%（34/95），差異有統計學意義（χ2=8.467，P=0.004）。

2.3 不同臨床特征ESCC 患者的ESCC 組織中DTL 表達情況的比較

不同病灶數目及組織學分級ESCC患者的ESCC組織中DTL 表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征ESCC 患者的ESCC 組織中DTL 表達情況的比較

2.4 生存情況的比較

DTL 陽性表達的ESCC 患者中位OS 明顯短于DTL 陰性表達患者，差異有統計學意義（P＜0.01）。（圖2）

圖2 DTL陽性表達（n=54）和陰性表達（n=41）ESCC患者的生存曲線

2.5 ESCC 患者預后影響因素的單因素及多因素分析

采用Cox 比例風險模型對ESCC 患者預后的影響因素進行分析。單因素分析結果顯示，DTL表達可能為ESCC 患者預后的影響因素（P＜0.05）。由于樣本量少，導致其他因素差異均無統計學意義（P＞0.05），故以P＜0.1 為界限，將單因素分析結果中DTL 表達和TNM 分期納入多因素分析，結果顯示，DTL 陽性表達是ESCC 患者預后的獨立危險因素（P＜0.01）。（表2）

表2 ESCC 患者預后影響因素的單因素及多因素分析

3 討論

DTL 可調節DNA 損傷修復、細胞周期和凋亡，還可引起染色體分離和細胞分裂缺陷，是細胞周期進展和基因組穩定性的關鍵調控因子[11]。此外，DTL 與腫瘤的關系已有研究報道。研究發現，在乳腺癌和肺癌中敲除DTL可抑制腫瘤細胞的生長[12]，且DTL 在多種腫瘤中被發現具有致癌功能，如宮頸腺癌、肝細胞癌和胃癌[13-15]。同時，有研究報道，DTL在ESCA 組織中高表達[9]，但其在ESCA發生發展過程中的具體臨床意義尚不明確。因此，本研究通過生物信息學和臨床試驗研究，探討DTL 是否能成為提示ESCA 進程和靶向治療的分子標志物。

本研究通過對TIMER2 數據庫進行挖掘，發現在轉錄水平上，DTL在ESCA 組織中表達顯著升高。同時，使用IHC 進行初步驗證發現，DTL 蛋白在ESCC 組織中表達升高，且其高表達與病灶數目、組織學分級有關，使ESCC 患者的總生存期變短。通過Cox 比例風險模型分析發現，DTL 陽性表達是ESCC 患者預后的獨立危險因素。綜合上述結果可知，DTL 可能參與了ESCC 的發生、發展并與不良預后相關。由此推測，DTL可能是與ESCC發生發展相關的致癌基因。

綜上所述，本研究揭示了DTL 表達水平與ESCC 患者臨床特征及預后的關系，表明其可能促進腫瘤的發生、發展且是預后的影響因素，有望成為ESCC 患者預后的潛在預測因子。然而，DTL 在ESCC 發生發展中的具體作用機制還不清楚，需要進一步的研究加以驗證，這正是課題組后期準備開展的工作。