腦和肌肉ARNT樣蛋白1、周期晝夜節律調節因子2、Notch1、糖原合成酶激酶-3β在結直腸腺癌組織中的表達及意義△

蔣海濤，杜勝奇，李福青，王紅#

1遵義醫科大學附屬醫院消化病醫院/遵義醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563000

2荊州市第一人民醫院消化內科，湖北 荊州 434000

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率居全球男性惡性腫瘤第三位，女性惡性腫瘤第二位[1]。結直腸癌的發生發展機制復雜，涉及多個基因及信號通路，具體機制不明，探索與之相關的基因和信號通路將有助于結直腸癌的早期診斷及治療。晝夜節律是哺乳動物維持機體正常代謝的重要前提，節律基因異常表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，節律基因腦和肌肉ARNT 樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1）和周期晝夜節律調節因子2（period circadian regulator 2，PER2）表達缺失可促進結直腸癌的發生[2-3]。Notch 通路是進化上高度保守的細胞信號轉導通路，主要由跨膜Notch 受體（Notch1～4）、Notch 配體（DLL1、DLL3、DLL4、JAG1 及JAG2）及DNA 結合蛋白CSL 組成，在結直腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中發揮重要作用，Notch信號通路異常所發揮的抑癌/促癌作用取決于細胞和組織內環境；但在結直腸癌中，Notch1普遍被認為是促癌基因[4-5]。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是糖原合成的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，既往被認為是潛在的抑癌因子，近年來被認為是晚期腫瘤細胞存活和增殖的積極調節因子。有研究認為，GSK-3 可調控視交叉上核中BMAL1、PER2等節律基因的表達，維持機體穩定的晝夜節律[6]；而GSK-3β與Notch1 又可能存在正向調控作用。本研究應用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription- polymerase chain reaction，RTPCR）及免疫組化法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β在不同結直腸組織中的表達情況，分析GSK-3β、BMAL1、PER2 及Notch1 表達的相關性，旨在為結直腸癌的診治提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年9月遵義醫科大學附屬醫院收治的結直腸癌患者。納入標準：經病理學檢查確診為結直腸癌；臨床資料完整。排除標準：術前已行放化療或免疫抑制劑治療；合并其他惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入61 例結直腸癌患者，取其中11 例手術切除的新鮮結直腸癌組織及相應癌旁組織，取50 例手術切除的結直腸腺癌及癌旁石蠟組織標本；另選取30例經內鏡切除的結直腸腺瘤患者的結直腸腺瘤石蠟組織標本。50 例結直腸腺癌患者中，男26 例，女24 例；年齡≥60 歲28 例，＜60 歲22 例；腫瘤類型：結腸腺癌31 例，直腸腺癌19 例；浸潤深度：T1～2期11 例，T3～4期39 例；腫瘤直徑：≥5 cm 26 例，＜5 cm 24 例；有淋巴結轉移20 例，無淋巴結轉移30 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期21 例；病理類型：管狀腺癌24 例，黏液腺癌24 例，乳頭狀腺癌2例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑

BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β、β-actin引物均由英淮捷基（上海）貿易有限公司提供；TransZol Up、逆轉錄試劑盒、RT-PCR 擴增試劑盒均購自北京全式金生物技術股份有限公司；二乙基焦碳酸酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水購自北京綠澤森生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗體BMAL1、PER2、Notch1 及兔抗人GSK-3β單克隆抗體均購自美國Abcam 公司；胰蛋白酶標記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、檸檬酸鹽緩沖液、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液均購自基因科技（上海）股份有限公司；通用型山羊血清購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TO 透明生物試劑購自廣州市鎮湖焊材有限公司。

1.3 實時熒光定量RT-PCR 法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 的相對表達量

取11 例手術切除的新鮮結直腸癌組織及相應癌旁組織標本，使用TransZol Up 試劑提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）進行PCR 反應，以β-actin為內參，采用相對定量2-△△Ct法計算BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3βmRNA 的相對表達量。引物序列：BMAL1上游引物5'-GCTAAGGATGGCTGTTCAGC-3'，下游引物5'-CTCGGTCACATCCTA-CGACA-3'；PER2上游引物5'-TCTGACCAGGTTGCATCCAT-3'，下游引物5'-CTTTTCCGGACACTGACACG-3'；Notch1上游引物5'-GATCTTCCCCTACTACGGCC-3'，下游引物5'-CACTGCCGGTTGTCAATCTC-3'；GSK-3β上游引物5'-CCCGACTAACACCACTGGAA-3'，下游引物5'-CTGTCCACGGTCTCCAGTAT-3'；β-actin上游引物5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'，下游引物5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'。

1.4 免疫組化法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達情況

取50 例手術切除的結直腸腺癌組織及相應癌旁組織，30 例經內鏡切除的結直腸腺瘤組織，石蠟固定后連續切片，依次進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復等步驟，免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法染色，依次滴加BMAL1（稀釋濃度1∶100）、PER2（稀釋濃度1∶100）、Notch1（稀釋濃度1∶200）、GSK-3β（稀釋濃度1∶100）。DAB 顯色，顯微鏡下隨機選取5 個高倍視野觀察，依據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分：無著色計0 分，淡黃色染色計1 分，棕黃色染色計2 分，棕褐色染色計3 分；陽性細胞所占比例＜5%計0 分，5%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中等陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件對所有數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗；BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β表達的相關性采用Spearman 相關分析；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織及癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 相對表達量的比較

結直腸癌組織中BMAL1、PER2mRNA 的相對表達量均低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）；結直腸癌組織和癌旁組織中Notch1、GSK-3βmRNA 的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 結直腸腺癌組織及癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 相對表達量的比較

2.2 結直腸腺癌組織、結直腸腺瘤組織、結直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達情況的比較

結直腸腺癌組織、結直腸腺瘤組織、結直腸腺癌癌旁組織中，BMAL1、PER2 的表達呈遞增趨勢，而Notch1、GSK-3β的表達呈遞減趨勢。BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白在結直腸腺癌組織、結直腸腺瘤組織及結直腸腺癌癌旁組織中表達情況的組間比較，差異均有統計學意義（H=40.960、34.034、26.163、31.938，P＜0.01）。除Notch1、GSK-3β蛋白在結直腸腺癌組織與結直腸腺瘤組織間的表達無明顯差異外，結直腸腺癌組織、結直腸腺瘤組織及結直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達情況兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、表2）

圖1 BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白在不同結直腸組織中的表達情況（免疫組化染色，×400）

表2 結直腸腺癌、結直腸腺瘤組織、結直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達情況

2.3 不同臨床特征結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、病理類型結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中BMAL1、Notch1 蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中BMAL1 蛋白表達分別高于無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（Z=2.855、2.180，P＜0.05）。淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中Notch1 蛋白表達分別高于無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（Z=2.465、2.174，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM 分期結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中PER2、GSK-3β蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；病理類型為黏液腺癌的結直腸腺癌組織中PER2 蛋白表達高于管狀腺癌，GSK-3β蛋白表達低于管狀腺癌，差異均有統計學意義（Z=2.833、2.633，P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達情況（n=50）

2.4 BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β表達的相關性分析

Spearman 相關分析結果顯示，結直腸癌組織中BMAL1 的表達與PER2 的表達呈正相關（r=0.332，P=0.018），PER2 的表達與GSK-3β的表達呈負相關（r=-0.291，P=0.040），Notch1的表達與GSK-3β的表達呈正相關（r=0.285，P=0.045），其余指標的表達均無相關性。

3 討論

晝夜節律是哺乳動物為適應地球上24 小時的晝夜循環而進化的，是保持機體正常運轉的重要前提，慢性晝夜節律紊亂促進了腫瘤的發生發展[7]。目前已知的節律基因包括時鐘基因（CLOCK）、BMAL1、PER1、PER2、PER3、神經元PAS 結構域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、隱花色素1（cryptochrome 1，Cry1）、隱花色素2（cryptochrome 2，Cry2）、Timeless（Tim）、視黃酸受體相關的孤兒受體（retinoic acid receptor-related orphan receptor，ROR）α/β/γ、核受體亞家族1 組D 成員1（nuclear receptor subfamily 1,group D,member 1，NR1D1）/孤兒核激素受體REV-ERBα等，控制著細胞周期和細胞有絲分裂在內的多種細胞功能。Stokes 等[3]的研究顯示，BMAL1可調節與再生和腸干細胞信號轉導有關的轉錄物，晝夜節律基因表達缺失促進了腫瘤的發生發展。本研究RT-PCR結果顯示，BMAL1、PER2基因在結直腸癌組織中表達下調，免疫組化結果顯示，BMAL1、PER2 蛋白在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及結直腸腺癌癌旁組織中的表達呈逐漸遞增趨勢，提示BMAL1、PER2蛋白表達上調可能能夠抑制正常結直腸組織向腺瘤及腺癌的轉變。BMAL1、PER2 與結直腸癌患者臨床特征的關系顯示，淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中BMAL1 蛋白表達分別高于無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示BMAL1 與結直腸癌的進展有關；而PER2 的表達僅與結直腸癌患者的病理類型有關，病理類型為黏液腺癌結直腸癌患者結直腸癌組織中PER2 蛋白的表達高于管狀腺癌，這可能與BMAL1、PER2 在結直腸癌中的陽性表達率過低及本研究納入的樣本量過少有關，有待進一步擴大研究樣本量來證實。

Notch 信號通路是高度保守的細胞信號轉導通路，Notch1～4 受體是細胞存活和功能的重要決定因素，Notch 可能是致癌性的，也可能是抑癌性的，這取決于組織和細胞環境。結腸解剖的功能單位是Lieberkuhn 隱窩，而Notch 受體的表達在隱窩底部的干細胞池中最高；目前研究認為，Notch1在結直腸癌中發揮促癌基因作用，但具體機制不明，可能涉及多個基因及信號通路[8]。本研究免疫組化結果顯示，結直腸癌組織中Notch1 蛋白的表達高于結直腸癌癌旁組織，證實Notch1 高表達與結直腸癌的發生發展密切相關。本研究分析Notch1 蛋白表達情況與結直腸癌患者臨床特征間的關系，結果顯示，淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結直腸腺癌患者結直腸腺癌組織中Notch1 蛋白表達分別高于無淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示Notch1 與結直腸癌的侵襲、轉移相關。

GSK-3 通過磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基，調節細胞中多種基本的生物過程。GSK-3β是WNT/β-連環蛋白（β-catenin）、Hedgehog（Hh）、Notch 和c-Myc 介導的主要促癌通路的關鍵成員。GSK-3在20世紀被認為是一種腫瘤抑制因子，而近年來的研究發現，GSK-3 亞型也顯示出致癌特性，參與了細胞周期、細胞凋亡、DNA 修復、腫瘤代謝、細胞侵襲和轉移等過程，上調了腫瘤細胞存活、增殖和耐藥的關鍵通路。GSK-3β表達失調在結腸隱窩細胞中可激活WNT通路，促進腫瘤的發生[1]。越來越多的證據將GSK-3β定義為腫瘤的潛在治療靶點，從而鼓勵開發用于腫瘤治療的GSK-3β抑制劑[9-10]。已有研究表明，在食管癌、結直腸癌、胰腺癌和乳腺癌細胞中抑制GSK-3β的活性可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制增殖，并且可以增強化療藥物和放療的療效[10-11]。本研究結果顯示，GSK-3β在結直腸癌組織中表達上調，再次證明GSK-3β在結直腸癌中發揮促癌基因的作用。

經典的Notch 信號通路激活過程：Notch 受體和配體結合，通過3 次裂解，釋放Notch 信號胞內結構區域（Notch intracellular domain，NICD），NICD轉移到細胞核后與CSL 蛋白結合形成轉錄活化復合體，協調下游基因的表達。Notch 信號的激活是多步驟的復雜過程，可在多個階段被調控，研究表明，GSK-3β磷酸化參與了NICD 的核定位，增加了Notch1 的轉錄活性，對Notch 信號具有重要的調控作用[12]。Cao 等[13]采用Notch 信號通路阻斷劑DAPT 作用于小鼠膠質細胞后顯示，在下調NICD和Notch1 蛋白表達的同時，GSK-3β的表達也出現顯著下調；而使用GSK-3β的抑制劑氯化鋰（LiCl）后，NICD 的表達也顯著下調，說明GSK-3β 與Notch 信號通路之間存在相互調控作用。本研究結果顯示，Notch1 的表達與GSK-3β的表達呈正相關，因此有理由推測GSK-3β與Notch1 在結直腸癌中可能也存在相互調控作用。

不僅如此，GSK-3 還能磷酸化多個核心時鐘蛋白（BMAL1、PER2、Cry2、和REV-ERBα），并作為核心時鐘調節的穩定器維持其節律性。BMAL1 和PER2可能通過RORα和REV-ERBα改變細胞增殖和成骨分化，影響WNT/β-catenin 通路，從而調節骨髓間充質干細胞的衰老[14]。在結直腸癌方面，有研究發現，在p53+/+HCT116 細胞株中，抑制GSK-3β的表達可以促進p53 的表達，從而發揮抗腫瘤作用[15]。目前GSK-3 磷酸化節律基因在結直腸癌中的研究鮮有報道，本研究顯示，PER2 的表達與GSK-3β的表達呈負相關，推測可能是因為GSK-3β磷酸化PER2 導致其表達被抑制，從而參與調控了結直腸癌的發生發展過程。

綜上所述，BMAL1、Notch 信號通路、GSK-3β均可能參與調控結直腸癌的發生、發展過程，且GSK-3β可能與BMAL1 和Notch 信號通路之間存在相互調控作用，這為結直腸癌發病機制的研究提供了新思路。通過抑制GSK-3β的表達來調控節律基因的表達及Notch 信號通路，可能成為結直腸癌防治的新思路。鋰劑是GSK-3β的特異性抑制劑，臨床長期用于治療雙相情感障礙，價格低廉，已被證明可以抑制腫瘤細胞轉移，在結直腸癌放療中的輔助作用也已被關注[16]；若能證明鋰劑在結直腸癌治療中的確切療效，將為腫瘤的靶向治療提供強有力的理論依據。