γ-氨基丁酸對甘草種子萌發(fā)及呼吸代謝的影響

吳繁琦, 王桂榮, 白 鈺, 張遠帆, 郭宜欣, 孫志蓉

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院, 北京 102488)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是豆科多年生草本植物,以干燥的根與根莖入藥,《神農本草經(jīng)》中將其列為上品,具有悠久的藥用歷史[1],廣泛應用于醫(yī)藥、食品、日化等領域。多年來的開采利用,導致甘草野生資源儲備量不足[2],目前人工栽培甘草的有效成分含量較低,還難以替代野生甘草,因此深入探討和研究不同環(huán)境中甘草的生長發(fā)育規(guī)律和生理生化機制,對提高甘草的產(chǎn)量和質量尤為重要。γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白氨基酸,廣泛存在于自然界生物中[3-4]。GABA是植物的內源性物質,在植物中具有信號轉導、增加抗逆性及調節(jié)植物生長發(fā)育等作用,近年來逐漸成為研究的熱點[5-8]。GABA由多胺代謝途徑或谷氨酸脫羧途徑合成,經(jīng)由GABA轉氨酶催化代謝,進入三羧酸循環(huán)[9-10]。已有研究證實,GABA可以調控擬南芥根毛的生長,也具有調節(jié)其氣孔閉合的作用[11-12]。賈璐婷[13]研究發(fā)現(xiàn),GABA可以影響水澇脅迫下東北山櫻的呼吸代謝。GABA在植物中的研究多集中在抗逆性方面,在藥用植物生理代謝中的影響作用研究相對較少,且其在藥用植物中的作用機制有待研究。當前GABA對藥用植物種子萌發(fā)與呼吸代謝方面的影響研究還是空白。本研究以甘草種子為材料,探討內、外源GABA對甘草種子萌發(fā)及呼吸代謝的影響作用,為深入研究GABA在藥用植物種子萌發(fā)期間的生理作用提供參考。

1 材 料

1.1 甘草種子

甘草種子購自中國中藥有限公司,品種為國甘1號(甘肅省種子管理局認定)。

1.2 試 劑

γ-氨基丁酸(上海阿拉丁生化科技有限公司)、對羥基苯甲醛(HBA)(上海源葉生物科技有限公司)、磷酸(北京化工廠)、氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠)、磷酸二氫鉀(上海源葉生物科技有限公司)、2,4-二硝基氟苯(上海麥克林生化科技有限公司)、乙腈(色譜純,美國Fisher chemical)、甲醇(色譜純,美國Fisher chemical)。

1.3 儀 器

萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司);十萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(國華常州儀器制造有限公司);BY-G 20醫(yī)用離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司);YCD-EL 260電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);SP-742 D型高速粉碎機(廣州市兆利電器實業(yè)有限公司);KQ-500 DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Angilent SB-Aq柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,安捷倫科技有限公司);Diamonsil AAA柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,北京迪科馬科技有限公司);安捷倫1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);島津LSM 780高效液相色譜儀(島津公司);Yaxin-1151生物氧測定儀(北京雅欣理儀科技有限公司)。

2 方 法

2.1 種子處理

選取大小、顏色一致的種子,稱重,去離子水沖洗,置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿中放置50粒種子。GABA(3個濃度)和GABA抑制劑(HBA)處理組,對照組中施加與處理液等體積的去離子水,每隔一段時間更換處理液或去離子水,各重復5次。試驗分組情況見表1。

表1 試驗分組情況

2.2 萌發(fā)指標測定

用天平分別測定處理0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,24 h,48 h的甘草種子質量。

種子吸脹速率參考Song S M[14]的方法計算。

RW=[(B-A)/A]×100%,

式中,A、B分別為種子吸水前和吸水后的重量。

參考李宗諭等[15]的方法統(tǒng)計24 h的萌發(fā)數(shù),計算24 h萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)。

萌發(fā)指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt);

活力指數(shù)=GI×S,

式中,Gt為每天發(fā)芽數(shù),Dt為對應發(fā)芽天數(shù),S為甘草種子鮮重。

2.3 呼吸速率測定

采用Yaxin-1151生物氧測定儀測定種子萌發(fā)8 h,24 h,48 h的呼吸速率,每組每次取3粒種子,沖洗,潔凈濾紙吸干種子表面水分,稱重,測定呼吸速率,各重復5次。

2.4 呼吸代謝物含量測定

2.4.1色譜條件

有機酸色譜條件參考袁文杰等[16]的方法。使用安捷倫1260高效液相;采用Angilent SB-Aq 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為0.1%磷酸水(A相)-乙腈(B相);設置等度洗脫A∶B=99∶1;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。

2.4.2供試品溶液制備

取處理48 h時的樣品,沖洗,干燥,粉碎,過40目篩,精密稱取0.2 g于具塞試管中,加入超純水,超聲提取,搖勻離心,取上清液,以0.22 μm濾膜過濾。待檢測呼吸代謝物有機酸。有機酸樣品色譜圖見圖1。

圖1 有機酸供試樣品色譜圖

2.4.3對照品溶液制備

精密稱取適量延胡索酸、琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸標準品于5 mL容量瓶中,加入超純水定容,制備得對照品溶液。精密移取各對照品溶液置于5 mL容量瓶中,定容,得到混合對照品溶液。精密移取適量混合對照品溶液,稀釋成不同濃度梯度標準品溶液,過0.22 μm濾膜,進樣檢測。以峰面積為縱坐標(Y)、質量濃度為橫坐標(X)建立線性方程,有機酸標準品圖譜見圖2,5種有機酸線性方程見表2。

圖2 有機酸標準品圖譜

表2 5種有機酸的線性方程

2.5 氨基酸含量測定

2.5.1色譜條件

氨基酸含量測定參考郭宇等[17]的方法。使用島津LSM 780高效液相;采用Diamonsil AAA柱(250×4.6 mm,5 μm);流動相為V甲醇∶V乙腈=10∶90(A相)-0.02 mol/L磷酸氫二鈉和0.02 mol/L磷酸二氫鈉(B相);設置梯度洗脫程序(表3);流速0.8 mL/min;柱溫45 ℃;進樣量10 μL。

表3 氨基酸梯度洗脫程序

2.5.2供試品溶液配制

樣品取樣與干燥等前處理同2.3.2。精密稱量0.2 g樣品粉末于具塞玻璃試管中,沸水提取,流水冷卻,離心,精密量取定量上清液于具塞玻璃試管中,加入0.5 mL的0.1 mol/L硼酸鈉水溶液與1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液,搖勻,60 ℃水浴,避光反應1 h。流水冷卻,以0.02 mol/L磷酸氫二鈉和0.02 mol/L磷酸二氫鈉水溶液定容至5 mL。過0.22 μm濾膜,待測。供試品色譜圖見圖3。

圖3 氨基酸供試樣品圖譜

2.5.3對照品溶液配制

精密稱取適量天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸標準品于5 mL容量瓶中,加入超純水定容,制備得5種氨基酸對照品溶液原液。各對照品原液精密移取定量溶液至5 mL容量瓶中定容,得到0.5 mg/mL對照品混合液。分別移取不同體積的對照品混合液加入具塞試管中,各加入0.5 mL的0.1 mol/L硼酸鈉水溶液與1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液,立即搖勻后于60 ℃水浴條件下避光反應1 h,后流水冷卻,定容于5 mL容量瓶中,0.22 μm濾膜過濾,進樣檢測。圖4為標準品圖譜。以峰面積為縱坐標(Y)、質量濃度為橫坐標(X)建立線性方程(表4)。

圖4 氨基酸標準品圖譜

表4 5種氨基酸線性方程

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics軟件進行數(shù)據(jù)分析,使用GraphPad Prism 7.0、Origin、Microsoft Office Excel 2007軟件作圖。

3 結 果

3.1 GABA對甘草種子萌發(fā)特性的影響

不同處理甘草種子萌發(fā)后的質量動態(tài)變化見圖5。由圖5可見,各處理種子質量有2個快速增長期,0～2 h間甘草種子吸脹作用強,24～48 h間種子萌生胚根,這兩個時期種子質量迅速增加。GABA處理組整體表現(xiàn)為隨著處理濃度增加,種子質量先增加后降低的趨勢,除G 3組外其余處理皆高于對照組,G 2組在48 h時達到0.195 g,是對照組的1.05倍。GABA抑制劑處理組的種子質量始終低于對照,隨著處理時間的增加抑制效果越明顯,處理48 h時對照組種子質量是GABA抑制劑處理組的1.1倍。

圖5 甘草種子萌發(fā)0～48 h間的質量變化

圖6為甘草種子萌發(fā)48 h內的吸脹速率變化,0～2 h間種子吸脹速率變化較快,2～4 h間變化速率趨于平緩,24～48 h間吸脹速率再次增加。吸脹速率整體表現(xiàn)為隨著GABA處理濃度的增加呈先升后降的趨勢,GABA的3個濃度處理均高于對照組,其中G 2組最高,在48 h時達到最大值(342.0%),是對照組的1.2倍, G 3組是對照組的1.04倍,其他組吸脹速率相近。

圖6 種子萌發(fā)48 h內的吸脹速率變化

萌發(fā)第24 h時,種子萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)見圖7,除G 3組外,GABA處理組種子活力指數(shù)均高于對照組,而所有處理組種子的萌發(fā)指數(shù)均高于對照組,且隨著GABA濃度增加,種子活力指數(shù)和萌發(fā)指數(shù)皆表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢,G 2組的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)分別為28.2和3.81,是對照組的1.38倍和1.45倍,且顯著高于其他4組,G 1組與H組之間活力指數(shù)與萌發(fā)指數(shù)差異不顯著,但與對照組相比差異顯著(p<0.05),G 3組與對照組差異無統(tǒng)計學意義。

注:處理間不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3.2 GABA對甘草種子呼吸速率的影響

甘草種子萌發(fā)第8 h、24 h、48 h的呼吸速率結果見圖8。對照組種子呼吸速率在8 h時最大,為0.22 nmol/(s·g),24 h時下降為0.12 nmol/(s·g),48 h時呼吸速率有所回升。GABA處理對呼吸速率有促進效果,GABA抑制劑組明顯抑制了種子的呼吸速率。萌發(fā)8 h時,GABA處理組的呼吸速率均高于處理組,其中G 2組呼吸速率在萌發(fā)第8 h時達到最大值,高于其他4個組,比對照組高19.82%。24 h時G 1組呼吸速率高于其他組,比對照組高10.00%。G 1組在48 h時達到呼吸速率最大值(0.23),是對照組的1.12倍,其他組呼吸速率均低于對照。GABA抑制劑處理組隨著時間推移抑制作用逐漸增強,48 h時呼吸速率為對照組的92.86%。

3.3 GABA對甘草種子呼吸代謝有機酸含量的影響

各處理甘草種子萌發(fā)48 h呼吸代謝有機酸的含量測定結果見圖9。種子中丙酮酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸以及延胡索酸總含量隨著GABA濃度增加呈先增后降的趨勢。各組之間丙酮酸含量差異較小,GABA處理組丙酮酸含量表現(xiàn)出隨著外源GABA含量增加而增加的趨勢,G 3組最高為0.167 mg/mL,GABA抑制劑組含量低于對照。GABA處理組中α-酮戊二酸的含量表現(xiàn)為隨著GABA處理濃度增加而降低,G 1含量最高,G 3含量最低,是對照組的39.72%,GABA抑制劑組含量高于其他組,是對照組的1.6倍。5組之間檸檬酸含量相近,對照組檸檬酸含量最高,G 3組含量最低,為0.274 mg/mL。GABA處理組琥珀酸含量均高于對照,處理組含量隨著GABA處理濃度增加而降低,G 1組含量最高(0.241 mg/mL),是對照組的1.2倍,GABA抑制劑組含量低于對照7.5%。GABA處理組延胡索酸含量趨勢表現(xiàn)為隨著外施GABA濃度增大而降低,G 1組濃度為0.026 mg/mL,略高于對照,GABA抑制劑組延胡索酸含量低于對照,是對照的86.3%。

圖9 種子中呼吸代謝有機酸含量

圖10 種子中氨基酸含量

3.4 GABA對甘草種子呼吸代謝氨基酸含量的影響

甘草種子中5種氨基酸含量相對較低。天冬氨酸和天冬酰胺含量變化趨勢基本相同,對照組含量最高,GABA處理組含量均表現(xiàn)為隨著GABA濃度增加而降低,GABA抑制劑處理組的含量與G 3處理組含量相近。G 3組谷氨酸含量最高,是對照組的1.07倍,G 1組次之,為對照組的1.04倍,G 2組為對照組的1.02倍。對照組谷氨酰胺含量高于處理組,為0.002 3 mg/mL。GABA抑制劑組的內源GABA含量高于對照組0.3%,G 1～G 3組內源GABA含量表現(xiàn)為隨外源GABA濃度增大而增大,其中G 3組含量最高,為對照組的1.27倍。

4 討 論

種子萌發(fā)是植物生命活動的起點,萌發(fā)伊始通過吸脹作用,促進水和氧進入種子內部,開啟萌發(fā)過程中一系列的物質代謝作用,呼吸作用是種子生命活動的核心,整個萌發(fā)過程離不開呼吸作用所提供的營養(yǎng)物質與能量[18]。GABA與其他單一處理不同,是植物體內的天然代謝物,研究GABA的作用機制對揭示藥用植物一系列生命活動與物質代謝間關系具有重要意義。當前已發(fā)現(xiàn)內源GABA可以調節(jié)碳、氮營養(yǎng)平衡,聯(lián)結三羧酸循環(huán)與氨基酸代謝,而三羧酸循環(huán)是植物呼吸的重要一環(huán);外源GABA可以改善脅迫條件下種子的活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)等外觀性狀指標[19-20]。GABA自身作為堿性物質,可能通過影響植物細胞內環(huán)境等其他渠道來影響植物萌發(fā)與呼吸代謝。HBA是GABA轉氨酶(GABA-T)抑制劑,可以抑制GABA參與植物的呼吸物質代謝作用[21]。設置GABA-T抑制劑處理組體現(xiàn)GABA的呼吸物質代謝途徑對植物的生長影響。因此,本研究通過設置不同濃度GABA處理,和GABA-T抑制劑處理,綜合分析種子質量、吸脹速率、活力與萌發(fā)指數(shù)、呼吸速率等外在生長指標,結合其內在成分指標:三羧酸循環(huán)的相關代謝產(chǎn)物有機酸和氨基酸的含量,探索內、外源GABA對甘草種子萌發(fā)的影響。

本研究結果表明,外施一定濃度GABA有助于促進甘草種子質量增長、吸脹速率以及呼吸速率增強,并且可以顯著提高種子的萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)(p<0.05)。其中外施2 mmol/L的GABA,種子的萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)、質量和吸脹速率最高,在48 h時質量與吸脹速率分別是對照組的1.05倍和1.2倍,8 h時對種子呼吸速率促進效果明顯,比對照組高19.82%。過量施加GABA的G 3組對種子萌發(fā)過程中質量變化、活力指數(shù)、萌發(fā)指數(shù)、呼吸速率等產(chǎn)生抑制作用。施加GABA-T抑制劑則會降低種子質量積累與呼吸速率,但萌發(fā)和活力指數(shù)仍表現(xiàn)為一定的促進效果,與G 3組相比,因抑制劑組的抑制原理區(qū)別于G 3高濃度抑制組,因此二者結果不同,結果的差異共同反映了GABA對種子萌發(fā)與呼吸代謝的影響。種子外在形態(tài)、性狀的改變是種子內在代謝活動變化的外在表現(xiàn),本研究進一步對種子內在代謝物質變化進行了探究,針對外源GABA以及GABA-T抑制劑影響甘草種子的生長與呼吸代謝的內在表征進行進一步闡述。

對甘草種子中三羧酸循環(huán)相關有機酸與氨基酸含量進行檢測,結果表明,外施GABA可以一定程度上提高種子內源GABA、TCA循環(huán)產(chǎn)物α-酮戊二酸、琥珀酸和谷氨酸等呼吸代謝相關產(chǎn)物的含量,降低延胡索酸、天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的積累量,其中琥珀酸含量的積累量增加最大,含量最高的G 1組為對照組的1.2倍。施加GABA-T抑制劑會降低甘草種子中TCA循環(huán)的產(chǎn)物琥珀酸、延胡索酸的含量,并且可以提高其前體物質α-酮戊二酸積累量,而對TCA循環(huán)上游物質丙酮酸和檸檬酸影響較小,施加GABA-T抑制劑可以同時降低呼吸代謝相關氨基酸天冬氨酸和天冬酰胺積累量,并提高種子內GABA含量。結果表明,施加GABA-T抑制劑可以抑制GABA參與呼吸代謝物質循環(huán),但同時因為抑制代謝會導致其在植物細胞內富集。綜上所述,外施GABA和GABA-T抑制劑能夠提高種子內GABA濃度,影響三羧酸循環(huán),降低天冬氨酸含量,而天冬酰胺為天冬氨酸的代謝物,因此結果表現(xiàn)為相似的趨勢。谷氨酸前體物質為α-酮戊二酸,外施GABA、GABA-T抑制劑均可以提高內源GABA和α-酮戊二酸的積累量,因此促使種子中谷氨酸含量的增加。

GABA可以影響甘草種子中的呼吸代謝。內在表現(xiàn)為種子中呼吸相關代謝物積累量的改變,外在表現(xiàn)為種子呼吸速率的變化以及質量積累、吸脹速率變化以及種子的活力與萌發(fā)指數(shù)變化。GABA促進種子呼吸代謝的同時,增加了種子的活力指數(shù)和萌發(fā)指數(shù),抑制GABA雖然抑制了呼吸速率和質量積累,但部分呼吸代謝相關成分表現(xiàn)為與GABA組相似的含量,種子的活力指數(shù)和萌發(fā)指數(shù)也與G 1組相似。GABA對甘草種子呼吸代謝的影響機制還有待進一步深入探究。

5 結 論

外施GABA可以在一定程度上提高甘草種子質量、呼吸速率、種子萌發(fā)24 h萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)以及吸脹速率,而且隨著外施GABA濃度的增加,整體呈先升后降的趨勢。外施2 mmol/L的GABA促進甘草種子萌發(fā)的作用最明顯,其萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)分別達28.2和3.81,顯著高于其他組(p<0.05)。針對呼吸代謝有機酸、氨基酸含量變化,外施GABA可以促進內源GABA以及丙酮酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、谷氨酸等呼吸相關代謝物含量增加,其中琥珀酸含量增加最大。抑制GABA代謝途徑則能促進天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等代謝物的積累。