大白菜BrFLC及BrFRI-LIKE基因對低溫的響應及其與抽薹性狀的關系研究

周麟筆, 馬關鵬, 趙夏云, 劉 峰, 劉 煉, 趙大芹

(1.貴州省農業科學院園藝研究所, 貴陽 550006; 2.貴州省園藝工程技術研究中心, 貴陽 550006;3.寧波城市職業技術學院景觀生態學院, 浙江 寧波 315100)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)屬十字花科蕓薹屬作物,是我國最重要的葉用蔬菜之一。2月正季多數大白菜抽薹開花,3—5月是蔬菜淡季,特別是大白菜淡季,因此種植春大白菜能取得很好的經濟效益。然而,越冬或早春栽培大白菜時,品種耐抽薹性不夠強就極易未熟抽薹,導致減產。因此,培育強耐抽薹性的春大白菜品種是一個非常重要的育種方向。 同時,揭示大白菜抽薹開花的調控機制,對鑒選耐抽薹性強的育種材料,創制特耐抽薹大白菜新品種具有十分重要的意義。植物成花過程受內部遺傳因子和外界環境因素共同調控[1],目前大量研究總結出了6條主要的開花調控途徑,即春化途徑、自主途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、溫度途徑和年齡途徑[2-6]。近年來,又有學者發現了2條新的開花調控途徑,即脫落酸途徑[7]和油菜素甾醇途徑[8]。這些調控途徑構成了復雜又精密的成花調控網絡。大白菜屬于低溫長日照植物,需經歷一定時間的低溫春化才能抽薹開花。FLOWERINGLOCUSC(FLC)和FRIGIDA(FRI)是決定擬南芥開花時間的兩個主要基因[9-10]。FLC作為春化途徑的關鍵基因,編碼了一個可以抑制開花的MADS-box 轉錄因子,這類轉錄因子通過結合啟動子抑制一組包括FT(FLOWERINGLOCUST)和SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1)在內的開花激活因子基因的轉錄抑制開花,擬南芥春化過程主要是通過改變開花抑制基因FLC染色質結構,抑制FLC的表達[11-12],以解除FLC對下游FT和SOC1等開花激活因子基因表達的抑制,從而促進開花[13-15]。FRI是FLC的轉錄激活因子,在FLC上游與FRIGIDA-LIKE 1 (FRL 1),FRIGIDA-ESSENTIAL 1 (FES 1), SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4 (SUF 4)和FLC EXPRESSOR (FLX) 等相互作用形成FRI復合體,結合到FLC啟動子特殊區域,誘導FLC的表達進而抑制開花[16-18]。Michaels等[19]研究表明,FRL 1在FRI促進FLC表達方面起特異性作用,且FRL 1、FRL 2和FRI都是冬季生態型擬南芥的習性所必需的。迄今為止,在白菜類植物中已克隆到BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5這4個擬南芥FLC的同源基因及2個擬南芥FRI的同源基因BrFRIa和BrFRIb[20-21],大白菜BrFLC與擬南芥FLC基因的功能相似,且不同抽薹性的大白菜對春化的敏感程度也不相同[22-23]。目前對大白菜BrFLC基因的研究主要集中在BrFLC堿基突變或缺失與抽薹性狀相關性方面,但多個BrFLC基因對低溫的響應及與抽薹性狀的關系尚不完全清楚。關于大白菜中擬南芥FRI、FRL等FRI-LIKE(FRIGIDA-LIKE)基因家族成員同源基因的研究也鮮有報道。

本研究通過自然低溫春化對5份大白菜材料進行耐抽薹性鑒定及研究人工低溫春化對現蕾期的影響,初步探究4個大白菜BrFLC基因及4個BrFRI-LIKE基因對低溫的響應機制,為進一步解析BrFLC及BrFRI-LIKE基因的功能,篩選耐抽薹性鑒定的候選基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為貴州省農業科學院園藝研究所大白菜課題組自育的5個大白菜品系:ZQY-75,ZQB-5,ZCB-3,ZRY-2,ZLQ-1。

1.2 大白菜低溫春化試驗

1.2.1大白菜自然低溫春化試驗

2021年10月29日,對參試材料進行穴盤育苗,2021年12月8日地膜覆蓋定植于田間,每個材料種植20株,在試驗過程中記錄試驗地的氣溫情況,分別統計各材料的成熟期、生育期[24]及現蕾期。在十字花科蔬菜耐抽薹性快速、高效鑒定的方法中,現蕾期是最可靠的指標之一[25],因此本試驗選用現蕾期作為耐抽薹性評價的指標。

耐抽薹性評價標準:現蕾期<120 d為不耐抽薹,120 d<現蕾期<140 d為一般耐抽薹,140 d<現蕾期<150 d為耐抽薹,現蕾期>150 d為強耐抽薹。

1.2.2大白菜人工低溫春化試驗

2022年3月24日,挑選籽粒飽滿的種子播種于花盆中,每個材料種20株,于25 ℃長日照條件(16 h光照,光照為2 000 lx)下進行培養。培養14 d后,將植株轉移到光照培養箱中,于4 ℃的低溫條件下培養50 d后,轉移至22 ℃的長日照條件(14 h光照,光照為2 000 lx)下生長(模擬貴陽5—6月氣候及光照條件設定)。統計各材料低溫處理結束至現蕾天數和現蕾期。

1.3 RT-qPCR試驗材料處理

將參試材料的種子消毒后,分別播種于含1%(W/V)蔗糖的MS固體培養基上,于25 ℃長日照條件(16 h光照)下培養。將培養14 d的幼苗轉移至光照培養箱中進行4 ℃低溫處理,分別于處理后0 h,48 h,72 h,96 h,144 h對幼苗進行取樣,每次取樣后迅速將材料置于液氮中速凍,并于-80 ℃保存備用。

1.4 目的基因的獲得

在BRAD數據庫(http://brassicadb.cn)中,下載擬南芥FLC、FRI、FRL1、FRL 2蛋白序列及大白菜全基因組蛋白序列文件(Brara Chiifu V 3.5 版本)和gff 3文件,構建本地BLASTP數據庫。將上述擬南芥蛋白序列進行本地BLASTP,剔除冗余序列后,使用SMART(https://smart.embl.de/)和Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)進行蛋白保守結構域鑒定,最終確定大白菜BrFLC、BrFRI及BrFRL1、BrFRL2基因信息。

1.5 基因表達分析

試驗采用天根公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取植株的總RNA,使用TAKARA公司反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),按照說明書操作合成cDNA。以大白菜BrTub-α為內參基因,引物設計參照Xiao等[26]的方法,根據目的基因序列信息設計RT-qPCR引物(表1),并通過PCR驗證引物的特異性。采用南京諾唯贊生物公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒,使用BIO-RAD CFX 96熒光定量PCR儀,進行RT-qPCR。反應體系及程序參照RT-qPCR試劑盒說明書。每個樣品設3次重復。采用2-△△CT的方法計算基因的相對表達量[27],采用Microsoft Excel 2019軟件進行數據處理,SPSS 20.0軟件進行多重比較。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結果與分析

2.1 自然低溫春化條件下大白菜的耐抽薹性比較

根據試驗期間試驗地的氣溫統計情況(表2),在整個試驗期內,月平均最低氣溫4.20 ℃,出現在2022年2月,日均氣溫10 ℃以下累計有100 d,4 ℃以下累計有34 d,完全能滿足大白菜對春化溫度和時間要求,利于大白菜耐抽薹性的鑒定評價。觀察記錄參試大白菜的成熟期,分別計算各材料的生育期和現蕾期(表3),統計結果顯示,ZCB-3的生育期最長,為139 d,在參試材料中屬于較晚熟品種, ZRY-2、ZLQ-1在2月下旬出現未熟抽薹,未能比較其品種熟性(表3);ZCB-3現蕾期最晚,為156.75 d,ZRY-2現蕾期最早,為113.85 d。參試材料的耐抽薹性由強到弱依次為ZCB-3、ZQB-5、ZQY-75、ZLQ-1、ZRY-2。耐抽薹性鑒定結果顯示,ZCB-3屬強耐抽薹材料,ZQB-5屬耐抽薹材料,ZQY-75屬一般耐抽薹材料,ZRY-2、ZLQ-1均為不耐抽薹材料。

表2 試驗期間氣溫統計

表3 大白菜物候期及現蕾期調查統計

2.2 人工低溫春化對大白菜現蕾時間的影響

幼苗經過4 ℃的低溫處理50 d后,ZCB-3需46.1 d才能全部現蕾,其次是ZQB-5,需要38.9 d,ZRY-2所需時間最短,在低溫處理后9.6 d完全現蕾(表4)。ZQY-75、ZQB-5、ZCB-3、ZRY-2、ZLQ-1現蕾期較自然低溫春化下分別提早43.1 d,41.75 d,46.65 d,40.25 d,41.8 d(表3,表4)。

表4 人工低溫條件下大白菜現蕾天數調查統計

2.3 大白菜BrFLC和BrFRI-LIKE基因的獲得

通過本地BLASTP和蛋白保守結構域鑒定,最終在大白菜中獲得4個擬南芥FLC同源基因,按照文獻[20]的研究結果,分別命名為BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5(表5);獲得2個擬南芥FRI同源基因,根據與擬南芥FRI的同源性命名為BrFRIa和BrFRIb(表5);獲得擬南芥FRL1同源基因1個,命名為BrFRL1,獲得FRL2同源基因1個,命名為BrFRL2(表5)。4個BrFLC基因編碼蛋白長度在196～220 aa之間,BrFLC1和BrFLC2分別分布在10號和2號染色體上,BrFLC3和BrFLC5分布在3染色體上;BrFRIa編碼蛋白長度為367 aa,位于10號染色體上,BrFRIb編碼蛋白長度為597 aa,位于3號染色體上;BrFRL1、BrFRL2編碼蛋白長度分別為452 aa和352 aa,分別位于10號和9號染色體上(表5)。

表5 大白菜BrFLC和BrFRI-LIKE基因的基本信息

2.4 大白菜BrFLC基因在低溫處理下的表達分析

在4 ℃低溫處理下,4個BrFLC基因在參試材料中的相對表達量均隨著處理時間的延長呈降低趨勢,且在低溫處理48 h時降幅最大,隨后在48～144 h之間,降幅逐漸變小。參試材料中,同一BrFLC基因在ZRY-2與ZLQ-1中的相對表達量之間差異不顯著,但在任何處理時期均低于在其他3份材料中的表達量且差異顯著(圖1)。

注:不同小寫字母表示在同一處理時期不同材料的基因相對表達量差異顯著(p<0.05)。下同。

BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3基因在5份材料中呈現較一致的表達趨勢,即在各個處理時期基因相對表達量總體趨勢為ZQY-75>ZQB-5>ZCB-3>ZRY-2>ZLQ-1(圖1 A、B、C);BrFLC5基因在5份材料中的相對表達量在各處理時期均表現為ZQB-5>ZCB-3>ZQY-75>ZLQ-1>ZRY-2(圖1 D)。在ZQY-75中,BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3基因在低溫處理48 h時,相對表達量下降幅度均大于其他4個材料(圖1 A、B、C);除BrFLC3之外,其余3個BrFLC基因在ZQB-5中的相對表達量在低溫處理各時期均高于ZCB-3,但在低溫處理開始時,4個BrFLC基因在這2份材料中的相對表達量之間差異不顯著(圖1)。

2.5 大白菜BrFRI-LIKE基因在低溫處理下的表達分析

在4 ℃低溫條件下,隨著處理時間的增加,4個BrFRI-LIKE基因在5份參試材料中的相對表達量整體呈上升趨勢(圖2);在任何處理時期,ZRY-2和ZLQ-1同一BrFRI-LIKE基因的相對表達量之間均無顯著差異,且表達量均顯著低于其他3個材料。在低溫處理144 h時,不同材料的BrFRIa、BrFRL1、BrFRL2基因的相對表達量均呈現ZQY-75>ZCB-3>ZQB-5>ZRY-2>ZLQ-1(圖2 A、C、D)。在ZCB-3中,低溫處理0 h,48 h,72 h,96 h時,BrFRIa、BrFRIb、BrFRL1基因的相對表達量分別低于ZQY-75、ZQB-5;在低溫處理144 h時,ZCB-3中4個BrFRI-LIKE基因的相對表達量均高于ZQB-5,而BrFRIb基因的相對表達量高于ZQY-75(圖2)。

圖2 大白菜BrFRI-LIKE基因在低溫處理下的表達分析

3 結論與討論

本研究對5份大白菜的耐抽薹性進行了比較鑒定,結果顯示,ZCB-3屬強耐抽薹材料,ZQB-5屬耐抽薹材料,ZQY-75屬一般耐抽薹材料,ZRY-2、ZLQ-1均為不耐抽薹材料。參試材料幼苗在經過4 ℃低溫處理50 d后,播種至抽薹時間較自然低溫春化縮短40 d以上,而自然低溫春化期間,平均氣溫4 ℃以下有34 d,說明低溫處理時間的延長能縮短大白菜現蕾時間,這與張魯剛等[28]的研究結果一致。

本研究對參試大白菜幼苗進行4 ℃低溫處理0～144 h,研究春化相關基因BrFLC(4個基因)及BrFRI-LIKE基因(4個基因)對低溫的響應。結果顯示,5份材料中,BrFLC基因均隨著處理時間的延長,相對表達量呈下降趨勢,且在處理48 h時,表達量降幅最大,之后降幅逐漸平緩,而BrFRI-LIKE基因則隨著處理時間的延長,表達量呈上升趨勢,表明BrFRI-LIKE基因與BrFLC基因未存在明顯的共表達趨勢,這與段文優[29]對甘藍型油菜的研究結果相似。對于溫度如何影響FRI對FLC基因的調控機理,最新研究揭示,在擬南芥中,春化早期低溫誘導大分子凝聚體(FRIGIDA凝聚體)的形成,但并不與活躍的FLC位點共定位,從而阻抑FRI激活FLC,以實現FLC轉錄下調的分子機制[30]。

此外,本研究發現,在低溫處理不同時間下,不耐抽薹的2個材料(ZRY-2和ZLQ-1)中BrFLC及BrFRI-LIKE基因在任何處理時期的相對表達量均處于較低水平,且顯著低于其他3份材料,說明BrFLC或BrFRI-LIKE基因的表達水平與大白菜的耐抽薹性有一定的相關性。ZQY-75和ZCB-3幼苗在人工低溫處理50 d后,現蕾期分別較自然低溫春化提前43.1 d,46.65 d,提前天數大于其他3份材料,且在低溫處理48 h時,這2份材料中4個BrFLC基因的相對表達量降幅最大,推測在短期低溫下,BrFLC基因相對表達量的降幅可能與現蕾期天數縮短有一定相關性。在參試材料中,BrFLC5基因在低溫下的表達水平高低與材料耐抽薹性強弱有一定的對應關系,說明BrFLC5與抽薹開花時間有較明顯的相關性,這與張學銘等[31]的研究結果相似。BrFLC5可作為一個用于初步篩選強耐抽薹性育種材料的候選基因。

本試驗中,低溫處理144 h時,4個BrFRI-LIKE基因在參試材料中相對表達量最高,但由于沒有更長的低溫時間處理作比較,這4個基因是否在低溫處理144 h時達到表達最高峰值,何時是表達量降低的拐點還需要進一步研究。同樣,在低溫處理144 h時,4個BrFLC-LIKE基因在參試材料中的相對表達量最低,但是否表達量的最低峰以及何時出現表達豐度回升的拐點還需進一步研究驗證。