肉蓯蓉和管花肉蓯蓉種子萌發及質量研究

朱文娟, 郭曄紅, 姜 侃, 杜 弢, 陳 垣

(1.甘肅農業大學農學院/省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室, 蘭州 730070;2.甘肅中醫藥大學, 蘭州 730000)

肉蓯蓉始載于《神農本草經》,列為上品,是名貴的滋補中藥材,具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效[1-2]。近年來,自然災害和生態環境惡化,導致肉蓯蓉的野生資源急劇下降,已被列入《中國植物紅皮書》,也是國際貿易的管制物種。《中國藥典》(2020年版)規定,肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)或管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schenk) Wight]干燥帶鱗葉的肉質莖。肉蓯蓉又名大蕓,寄生于藜科植物梭梭[Haloxylonammodendron(C. A. Mey.) Bunge]和白梭梭(HaloxylonPersicumBunge ex Boiss. Et Buhse)的根部。管花肉蓯蓉又名紅柳大蕓,寄生于檉柳屬(Tamarix)植物的根部[3]。為滿足市場需求,人工種植逐漸發展起來,種植肉蓯蓉和管花肉蓯蓉成為肉蓯蓉藥材的主要來源。

肉蓯蓉和管花肉蓯蓉都是專性寄生植物,人工種植需要先栽培其寄主植物,然后用肉蓯蓉或管花肉蓯蓉的種子接種[4],種子質量直接影響藥材的產量和品質。目前,肉蓯蓉種子的生產規模小,種質混雜且存在萌發率低甚至不萌發等問題,種子質量成為制約肉蓯蓉高產及規范化種植的重要因素。建立全面系統的種子質量檢驗方法,對種子進行質量檢驗和篩選,接種高質量種子,可以在源頭上提升肉蓯蓉藥材的種植效率。周峰等[5]研究發現,根寄生植物的種子萌發具有特異性,剛成熟的種子需要在低溫下完成胚的后熟,再經過一段時間的預培養,在合適濃度的寄主根系分泌物誘導下才能萌發。大多數植物的種子萌發受赤霉素和脫落酸平衡的調節,赤霉素可以促進種子萌發,脫落酸則維持種子休眠,抑制種子萌發,氟啶酮和氟草敏可以抑制類胡蘿卜素的生物合成從而抑制脫落酸的生物合成[6-7]。因此,本研究以赤霉素、氟啶酮、氟草敏處理種子,探索肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的快速萌發條件。

目前,鮮有文獻研究肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子質量檢驗規程。本試驗以肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子為材料,優化出肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的快速萌發條件,解決專性寄生和生理休眠所致的種子發芽周期長、發芽率低的問題;參照《農作物種子檢驗規程》,建立了包括真實性、大小、凈度、千粒重、含水量、發芽率等指標的種子質量檢驗方法,初步制訂肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子質量檢驗規程;收集市售及種植基地的種子共45份,包括37份肉蓯蓉種子和8份管花肉蓯蓉種子,調查種子的質量現狀,以期為其種子質量檢驗提供科學依據,促進肉蓯蓉藥材的高效率種植。

1 材料與方法

1.1 種子樣本

肉蓯蓉種子采集于甘肅省白銀市靖遠縣,管花肉蓯蓉種子產自新疆維吾爾自治區于田縣奧依托格拉克鄉喀拉庫木什村。種子質量調查的樣本詳見表1,將種子裝在牛皮紙信封袋中,存放于4 ℃冰箱備用。

表1 肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子質量調查樣本

1.2 儀器與試劑

場發射掃描電鏡(美國-FEI-Quanta 250 FEG),環境掃描電鏡(美國-FEI-Quanta FEG 250),光學顯微鏡(OLYMPUSCKX 53),真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司,DZF-6050型),恒溫光照培養箱(BoxunBSP-150)。

次氯酸鈉溶液(Innochem),赤霉素(Aladdin,95%),氟啶酮(Aladdin,分析標準品),氟草敏(Aladdin,分析標準品)。

1.3 方 法

1.3.1種子的形態鑒定

利用掃描電鏡和環境掃描電鏡觀察肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子在干燥狀態和吸水狀態下的形態特征。隨機取10粒干燥成熟的凈種子,均勻粘貼在導電膠上,噴金60 s,在掃描電鏡下觀察并拍照,利用Nano Measurer 1.2軟件計算種子的長度和寬度;隨機取吸水狀態和發芽狀態的種子,將其粘貼在導電膠上,迅速在環境掃描電鏡下觀察并拍照。

種子在蒸餾水中充分吸脹后,用鑷子及解剖針去掉種皮,將種仁粘貼在導電膠上,滴水保持樣品的水分,在環境掃描電鏡下觀察種仁的結構特征。使用解剖刀將種子橫切,按照切面向上和切面向下,將樣品粘貼在導電膠上,噴金60 s,在掃描電鏡下觀察并拍照[8]。

1.3.2發芽率測定

種子萌發采用培養皿濾紙法,包括浸種、赤霉素溶液預處理、種子消毒、萌發培養等4個階段。分別取適量肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的凈種子,用蒸餾水將種子沖洗3次,置于15 mL無菌離心管中,加入10 mL蒸餾水,在25 ℃黑暗條件下浸泡24 h[9],使種子充分吸脹。此時種皮的蜂窩狀小孔中所帶雜質更容易沖掉,再用蒸餾水沖洗2次,防止種子在萌發培養過程中發霉。離心管中換入10 mL赤霉素溶液,25 ℃黑暗條件下浸種72 h。換入12 mL 2%次氯酸鈉溶液,搖勻,使種子充分消毒10 min以殺滅種皮攜帶的真菌和細菌等,用無菌水沖洗3次,備用。

用鑷子取2層已滅菌的90 mm濾紙,置于90 mm無菌培養皿中,加入4 mL培養液,每個培養皿中按照5行、每行10粒的方式放置50粒種子,以封口膜封住培養皿,在25 ℃黑暗條件下培養21 d。每7 d統計一次發芽種子數,去除已經發芽的種子,補加1 mL蒸餾水,計算發芽勢和發芽率[10]。

首先,比較氟啶酮和氟草敏對種子萌發的影響,篩選出適宜肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的培養物質。取種子0.5 g,以10 mg/L赤霉素溶液預處理72 h。使用不同濃度的氟啶酮或氟草敏溶液作為培養液,設0,0.1,1.0,10,100,200 mg/L等6個處理,每個處理重復3次,計算發芽勢和發芽率。

其次,考察不同濃度赤霉素預處理對肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的影響。以10 mg/L適宜培養物質作為培養液,赤霉素濃度設0,0.1,1.0,10,100,1 000 mg/L等6個處理,每個處理取0.5 g種子,重復3次,計算發芽勢和發芽率。

最后,比較培養液濃度對肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的影響。取種子0.5 g,以最佳濃度赤霉素預處理種子,培養液濃度設0,0.01,0.1,1.0,10,100,200 mg/L等7個處理,每個處理重復3次,計算發芽率。

1.3.3千粒重測定

將樣品充分混勻,采用四分法分取初次樣品和試驗樣品,以百粒法、二百粒法、五百粒法、千粒法分別測定肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的千粒重,即隨機數取100,200,500,1 000粒種子,在萬分之一分析天平上稱重并記錄,計算1 000粒種子的重量。利用SPSS 19.0軟件統計重復間的變異系數以及不同測定方法的差異顯著性。

1.3.4凈度測定

種子凈度的高低受采收、清選等外部因素影響,并非種子的生物學特性[11],通過檢測樣品中不同成分的百分率和混合物特性可以推測種子批的組成。按照《農作物種子檢驗規程》的規定,試驗樣品應至少含有2 500個種子單位的重量,樣品在分析前后增失比例不得超過5%。通過千粒質量的測定,估計合適的試驗樣品重量,將試驗樣品分為凈種子、其他植物種子和雜質,分別稱重記錄,計算各成分的重量百分率,重復4次。肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子樣本中均未見其他植物種子,因此凈度不計算這一項。

1.3.5水分測定

水分測定必須使種子中自由水和束縛水全部除去,并最大可能減少氧化、分解或其他揮發性物質的損失。本試驗采用高恒溫烘干法(133±1)℃測定種子的含水量[12],將烘箱預熱至指定溫度,稱量瓶及其蓋子分別編號。取肉蓯蓉的凈種子(0.5±0.02)g,管花肉蓯蓉的凈種子(0.3±0.02)g,重復3次,開始烘烤并計時。每隔1 h蓋上稱量瓶蓋子,取出放入干燥器內冷卻至室溫,稱重記錄。

1.3.6肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的質量現狀調查

采用建立的種子質量檢驗方法,對收集到的37份肉蓯蓉種子(H 1～H 37)和8份管花肉蓯蓉種子(G 1～G 8)進行質量檢驗(表1)。測定種子的長度、寬度、凈度、千粒重、含水率和發芽率,每個樣本重復3次,使用SPSS 19.0軟件進行數據分析,比較不同來源種子的質量,分析種子質量現狀。

2 結果與分析

2.1 種子的形態特征

肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子都呈黑色或黑褐色,種仁呈白色或褐色。如圖1和圖2所示,兩種肉蓯蓉種子的種皮上均布滿蜂窩狀的不規則多邊形小孔,且有一層薄膜覆蓋在孔上,大部分薄膜已脫落,孔壁上具有條狀紋飾。種臍為近圓形,種皮和種仁之間存在間隙,易于分離,種仁表面具有網格狀紋飾。

注:A 1為種子(30×);A 2為種子(500×);A 3為種子(300×);A 4為種子的橫切面(110×);A 5為吸水狀態的種子(1 500×);A 6為種仁(1 000×)。

注:B 1為種子(30×);B 2為種子(500×);B 3為種臍(600×);B 4為種子的橫切面(120×);B 5為吸水狀態的種子(2 500×);B 6為種仁(1 000×)。

肉蓯蓉種子形狀不規則,多數為一端鈍圓一端尖,少數種子為長圓形,種臍位于尖端。種子吸水后細胞膨脹,外種皮孔壁上可見不連續的條狀紋飾和內凹小孔。管花肉蓯蓉種子呈近球形,種子吸水后,外種皮孔壁上的條狀紋飾均勻增厚,紋路連續,這可作為與肉蓯蓉種子的鑒別點。

2.2 種子的萌發條件

2.2.1萌發培養物質的篩選

空白試驗表明,不添加任何外源物質,在蒸餾水條件下,肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子30 d內均不發芽。由圖3和圖4可知,肉蓯蓉種子以10 mg/L赤霉素溶液預處理72 h后,10 mg/L氟啶酮培養,可使發芽率增加至66.67%;100 mg/L氟草敏培養,可使發芽率增加至58.67%。因此,擬定氟啶酮溶液作為肉蓯蓉種子的萌發培養液。

注:不同小寫字母表示p<0.05差異顯著。下同。

圖4 氟草敏對肉蓯蓉種子萌發的影響

肉蓯蓉種子在培養7 d內開始萌發,其發芽勢以培養7 d時的發芽數計算。僅在低濃度(0～10 mg/L)的培養液條件下,種子發芽勢與發芽率的升降趨勢一致;當培養液濃度為10～200 mg/L時,種子發芽勢與氟啶酮濃度呈正相關,高濃度的氟草敏則導致種子發芽勢下降。

由圖5和圖6可知,10 mg/L赤霉素溶液預處理管花肉蓯蓉種子72 h后,在蒸餾水培養條件下,其發芽率為24%;1 mg/L氟啶酮培養,可使發芽率增加至64%;0.1 mg/L氟草敏培養,可使發芽率增加至64.67%。氟啶酮或氟草敏培養,種子的最高發芽率僅相差0.67%,二者都可以作為管花肉蓯蓉種子的萌發培養物質。為和肉蓯蓉種子統一,本文以氟啶酮作為管花肉蓯蓉種子的萌發培養物質。

圖5 氟啶酮對管花肉蓯蓉種子萌發的影響

圖6 氟草敏對管花肉蓯蓉種子萌發的影響

在所有的處理水平下,管花肉蓯蓉種子培養7 d內均未見萌發,其發芽勢以14 d內的發芽總數計算。在0～200 mg/L培養液濃度范圍內,發芽勢和發芽率升降趨勢一致。

2.2.2赤霉素濃度的篩選

基于上述結果,以10 mg/L氟啶酮作為肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的萌發培養液,考察赤霉素預處理濃度對種子萌發的影響。由圖7可知,肉蓯蓉種子不進行預處理,以10 mg/L氟啶酮溶液培養,也可以促進其萌發,發芽率為39.33%。赤霉素預處理對種子萌發具有顯著的促進作用(p<0.05),不同濃度赤霉素預處理下,種子發芽勢和發芽率的升降趨勢一致。當赤霉素預處理溶液的濃度為1 000 mg/L時,促進種子發芽的效果最為顯著,發芽率可提高至87.33%,發芽勢達到最大。

圖7 赤霉素對肉蓯蓉種子萌發的影響

由圖8可知,一定濃度的赤霉素預處理可以顯著促進管花肉蓯蓉種子的萌發,在0～1000 mg/L赤霉素濃度范圍內,種子的發芽率和發芽勢變化趨勢一致。對種子不進行預處理,在10 mg/L氟啶酮培養條件下其發芽率為66%。1 mg/L赤霉素對管花肉蓯蓉種子的萌發促進效果最好,可使發芽率提高至72.67%,發芽勢達到最大。

圖8 赤霉素對管花肉蓯蓉種子萌發的影響

2.2.3不同培養方式對種子萌發的影響

為研究單一赤霉素、氟啶酮或二者組合對肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的影響,以2.2.1項下的最佳濃度氟啶酮作為培養液,以2.2.2項下的最佳濃度赤霉素預處理種子,種子的發芽率如表2所示。不添加外源物質的條件下,肉蓯蓉種子不萌發;1 000 mg/L赤霉素預處理,蒸餾水培養條件下,發芽率為18%;對種子不進行預處理,僅以100 mg/L氟啶酮溶液培養,發芽率可達65%;1 000 mg/L赤霉素預處理,100 mg/L氟啶酮溶液培養,種子的發芽率可達87%。赤霉素、氟啶酮、赤霉素+氟啶酮等3種培養方式下,種子的發芽率差異顯著,赤霉素預處理和氟啶酮培養能夠協同促進肉蓯蓉種子的萌發。

表2 赤霉素和氟啶酮對肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的影響

不添加外源物質的條件下,管花肉蓯蓉種子不萌發;1 mg/L赤霉素預處理,蒸餾水培養條件下,發芽率為0;對種子不進行預處理,以1 mg/L氟啶酮溶液培養,發芽率可達65%;1 mg/L赤霉素預處理,1 mg/L氟啶酮溶液培養,種子的發芽率為47%。相比于單一氟啶酮培養,最佳濃度赤霉素預處理和最佳濃度氟啶酮培養條件下,種子發芽率由65%下降至47%。由此可見,赤霉素和氟啶酮在調控管花肉蓯蓉種子的萌發時是相互影響的,這種影響并不是簡單的協同促進作用。

2.2.4氟啶酮培養液濃度的篩選

如圖9所示,1 000 mg/L赤霉素預處理肉蓯蓉種子后,蒸餾水培養條件下發芽率為18%,0.01 mg/L氟啶酮培養可使發芽率顯著增加至88.67%,達到最大。之后隨著氟啶酮濃度的增大,發芽率變化趨勢平緩,在1～200 mg/L氟啶酮濃度范圍內,種子發芽率都在80%以上。因此,肉蓯蓉種子的最佳萌發條件為25 ℃黑暗下、蒸餾水中吸脹24 h、1 000 mg/L赤霉素預處理72 h、0.01 mg/L氟啶酮培養21 d。管花肉蓯蓉種子在1 mg/L赤霉素溶液預處理下,其發芽率隨著氟啶酮濃度的增加先升后降,在氟啶酮濃度為100 mg/L時發芽率最高,為77%。因此,管花肉蓯蓉種子的最佳萌發條件為25 ℃黑暗下,蒸餾水中吸脹24 h,1 mg/L赤霉素預處理72 h,100 mg/L氟啶酮培養21 d。

圖9 氟啶酮培養液濃度對肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子萌發的影響

2.3 千粒重測定方法

不同測定方法測得的肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的千粒重如表3所示。4種測定方法測得的肉蓯蓉種子千粒重,變異系數均小于4%,百粒法和二百粒法與其他兩種方法的測定結果差異顯著(p<0.05),誤差較大,這可能是肉蓯蓉種子形狀不規則所致。因此,肉蓯蓉種子的千粒重測定宜采用五百粒法。4種方法測得的管花肉蓯蓉種子千粒重沒有顯著差異,百粒法的變異系數為5.87%,不符合規定,二百粒法可作為管花肉蓯蓉種子的千粒重測定方法。

表3 肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的千粒重測定

2.4 凈度分析方法

由千粒重測定結果可知,肉蓯蓉種子的千粒重為0.084 4 g左右,2 500粒種子的質量約為0.21 g。管花肉蓯蓉種子的千粒重為0.048 3 g左右,2 500粒種子的質量約為0.12 g。按照凈度分析的試驗樣品應至少含有2 500個種子單位,送驗樣品的質量為試驗樣品的10倍。考慮到樣品通常含有雜質,確定肉蓯蓉種子的凈度分析送驗樣品為2.5 g,試驗樣品為0.25 g;管花肉蓯蓉種子的凈度分析送驗樣品為1.5 g,試驗樣品為0.15 g,凈度分析結果如表4所示,各處理在分析前后樣品的增失比例均小于5%,方法和程序切實可行。

表4 肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的凈度分析

2.5 水分測定方法

種子以(133±1)℃烘6 h,不同時間測得的含水率如圖10所示,在最初的2 h內,種子快速失水,隨后失水緩慢,3 h及以后測得的種子含水率趨于穩定,(133±1)℃烘干3 h可作為肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的水分測定方法。

圖10 高恒溫烘干法測定肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的水分

2.6 肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子質量檢驗規程

通過研究種子形態特征、凈度、千粒重、含水率、發芽率的測定方法,制訂了肉蓯蓉種子質量檢驗規程(表5)和管花肉蓯蓉種子質量檢驗規程(表6)。

表5 肉蓯蓉種子質量檢驗規程

表6 管花肉蓯蓉種子質量檢驗規程

2.7 種子的質量現狀調查

肉蓯蓉種子的質量檢驗結果詳見表7,本次收集的種子凈度范圍在67.78%～99.64%之間。其中,凈度>90%的種子占84%,少數種子中摻入了和種子大小、形狀較為相似的沙粒。肉蓯蓉種子的長度為0.71～1.18 mm,寬度0.52～0.83 mm,千粒重在0.069 7～0.136 5 g之間,含水率3.39%～5.87%。種子的發芽率相差較大,最低為20.67%,最高為92.67%。其中,32%的種子發芽率在20%～50%之間,51%的種子發芽率在50%～80%之間,發芽率80%以上的種子占16%。

表7 肉蓯蓉種子的質量檢驗結果

管花肉蓯蓉種子的質量檢驗結果詳見表8,凈度在76.5%～95.92%之間,長度為0.72～0.87 mm,寬度為0.56～0.73 mm,千粒重在0.021 8～0.047 3 g之間,含水率4.37%～5.08%,發芽率最低為0,最高為76.67%。

表8 管花肉蓯蓉種子的質量檢驗結果

3 討論與小結

肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子極小,肉眼難以準確鑒定,人工測量大小時誤差大。掃描電鏡具有制樣簡單、快速準確的優點,NanoMeasurer 1.2軟件能夠準確測量種子的長度和寬度。本研究利用掃描電鏡和環境掃描電鏡觀察了肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的形狀、種皮結構、橫切面、種臍以及種仁的特征,這對種子形態鑒定是重要的補充。種子吸水后細胞膨脹,肉蓯蓉種子的外種皮孔壁上可見不連續的條狀紋飾和內凹小孔,管花肉蓯蓉種子的外種皮孔壁上,條狀紋飾均勻增厚,紋路連續,且孔壁不存在內凹小孔。從種子的掃描電鏡圖像可見,種皮的蜂窩狀小孔中存在大量雜質,這也是發芽率測定過程中種子容易發霉的原因,在測定前需對種子進行充分清洗和消毒。肉蓯蓉種子的形狀不規則,單粒種子之間質量差異較大,這可能是百粒法和二百粒法測得的千粒重誤差較大的原因,五百粒法測量千粒重較為合適。

以赤霉素預處理,氟啶酮或氟草敏培養,可以顯著促進肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子的萌發。與氟草敏相比,氟啶酮對肉蓯蓉種子的促進萌發效果更好。管花肉蓯蓉種子以氟啶酮或氟草敏培養,最高的發芽率僅相差0.67%,二者都可以作為其萌發培養物質。肉蓯蓉種子在培養7 d以內開始萌發,管花肉蓯蓉種子在培養7～14 d迅速萌發,兩種肉蓯蓉種子的萌發速度不一樣。發芽率直接影響田間接種率和種植效率,本次收集的種子質量參差不齊,發芽率差異較大,種子存在萌發率低甚至不萌發的現象。這可能是種子在采收時成熟度不夠,或者發霉導致種子內含物被微生物消耗所致。

本試驗通過對種子真實性、大小、凈度、千粒重、含水量和發芽率的測定方法進行研究,建立了肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的種子質量檢驗規程,方法具有良好的可行性和重復性。采用掃描電鏡和環境掃描電鏡可以快速鑒定肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子。肉蓯蓉種子和管花肉蓯蓉種子以赤霉素預處理,經氟啶酮或氟草敏培養,可以顯著促進萌發,解決了發芽率測定過程中萌發率低、萌發周期長的問題。不同來源的種子質量差異較大,存在萌發率低或者不萌發的情況,在接種前應對種子進行質量檢驗和篩選,保障萌發率和接種率,促進肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的高效率種植。