甘藍型油菜胚離體胚性生長培養體系的構建

劉有民, 孫 超, 張培竹, 米 超, 周 超, 汪 騫, 林良斌

(1.云南農業大學農學與生物技術學院, 昆明 650201;2.云南省羅平縣農業技術推廣中心, 云南 曲靖 655800)

油菜是我國重要的油料作物,菜籽油和油菜籽的生產對我國油脂油料市場影響巨大[1]。研究表明,油菜種子含油量是受母體基因型、胚基因型、細胞質基因型等遺傳效應和田間環境因素影響的復雜數量遺傳性狀[2-4]。目前,關于此方面的研究均來自田間數據分析,而含油量是綜合因素影響的結果,不能很好地反映單因素對含油量的影響。而利用胚離體培養技術,不僅可以排除田間環境因素的影響,還可以排除母體效應(母體組織角果皮)影響,從而能很好地研究胚效應及正反交種子的細胞質效應,所以建立油菜離體胚維持胚性生長的培養體系是獨立研究油菜種子含油量某種效應的關鍵。姜嬌等[5]采用胚挽救技術,將甘藍型油菜細胞質雄性不育系(Ogura CMS)的恢復基因轉至甘藍Ogura CMS材料上, 獲得Ogura CMS甘藍與甘藍型油菜的種間雜種。趙艷艷等[6]將結球甘藍與含根腫病抗性基因CCR的人工合成油菜雜交,通過對雜交后代胚挽救,獲得了抗根腫病的甘藍新材料。以上研究均是通過胚離體培養來獲得其再生植株,不需要維持胚性生長。Avjioglu,Knox等[7]和鄧林彬等[8]以胚的油脂含量及胚干重來確定胚離體培養的最佳體外培養體系,雖然提到了甘藍型油菜離體培養胚的胚性生長狀況,然而并未闡述維持胚性生長的最佳條件。本研究以甘藍型油菜ZY 511第22 DAP(Days after pollination)幼胚為研究材料,探索胚離體培養的影響因素,建立油菜胚離體培養最佳胚性生長體系,為油菜種子含油量的遺傳機制研究提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為甘藍型油菜ZY 511,含油量為51%。2021年10月5日播種于云南農業大學后山實驗基地(102° E,25° N,海拔1 945 m),株距為0.25 m,行距為0.40 m,每行6株,共20行。

取材時挑選ZY 511第22 DAP主花序上的新鮮角果,長度大小要盡量一致,剝取其幼胚進行離體培養。

1.2 方 法

1.2.1種子胚剝取及離體培養

將田間選取的新鮮角果立即帶回組培室,置于超凈工作臺上進行滅菌處理。用無菌水浸洗3次,每次5 min,隨后用75%乙醇浸泡3 min,然后用無菌水沖洗5 min后用0.1%升汞消毒15 min,最后用無菌水浸洗3次,每次5 min。將消毒完的角果置于無菌濾紙上吸干角果皮上的水分,剝取種子,用無菌的尖頭鑷子戳破幼嫩種皮,取出完整胚接種于固體培養基上。在每個直徑9 cm的培養皿內放置24個離體胚,3次重復。培養皿置于光照培養箱中,光照強度設置為40 μmol/(m2·s),溫度設置為24 ℃,以16 h光照8 h黑暗的光周期進行培養。體外培養20 d后測定其胚性生長率。

1.2.2培養基篩選

本實驗選用MS、B 5和N 6培養基作為初始培養基,三者均為不含蔗糖和瓊脂的粉末狀培養基。3種培養基配制過程為:分別稱取MS培養基4.74 g、B 5培養基3.21 g、N 6培養基3.99 g,蔗糖濃度6%,瓊脂濃度0.4%,加入1 L蒸餾水,配制成3種不同的固體培養基,調節pH值為 5.8,于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后冷卻至45 ℃左右進行倒平板。將剝取的幼胚進行離體培養,對在不同培養基培養下的生長狀況進行比較,得出最適培養基,再進行后續實驗篩選。

1.2.3蔗糖濃度篩選

在最適培養基中添加蔗糖進行重新篩選。分別設置4%,6%,8%,10%,12%等5個蔗糖濃度處理,瓊脂濃度4%,配制成5種不同的固體培養基,測定不同濃度的蔗糖對離體幼胚的胚性生長的影響,確定最適蔗糖濃度。

1.2.4瓊脂濃度篩選

在最適培養基+最適蔗糖濃度的培養基中設置5個瓊脂濃度,分別添加0.4%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%的瓊脂,研究不同濃度的瓊脂對離體幼胚的胚性生長的影響,用以確定最適瓊脂濃度。

1.2.5激素濃度配比篩選

在得到最適培養基+最適蔗糖濃度+最適瓊脂濃度后,以新獲得的培養基為基礎培養基,加入不同濃度的NAA(0,0.05,0.10,0.15 mg/L)和6-BA(0.05,0.10,0.15,0.20 mg/L),這兩種激素共設置了16種激素濃度配比組合,通過對培養基中不同濃度配比對離體幼胚的胚性生長影響的檢測,篩選這兩種激素的最適濃度配比組合。

1.3 實驗數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010和IBM SPSS Statistics 26軟件處理數據。

胚性生長率/%=(胚性生長胚數/胚總數)×100%;

愈傷組織率/%=(愈傷組織胚數/胚總數)×100%;

生根率/%=(生根胚數/胚總數)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對油菜離體培養胚胚性生長的影響

油菜胚離體培養中,培養基為離體胚的生長所需提供了各種營養物質,而合適的培養基對離體胚的生長至關重要。本研究以B 5、MS和N 6培養基為基礎培養基,對甘藍型油菜22 DAF種子進行20 d胚離體培養和生長狀況分析。結果顯示,在不同培養基中的胚均出現子葉片增大,子葉柄伸長和膨大狀況,但胚的生長狀況差異較明顯(圖1)。B 5中大部分胚能維持胚性生長狀態,只有部分胚有愈傷組織出現,胚性生長率達89.06%,顯著高于N 6和MS培養基,胚的愈傷率、生根率均顯著低于N 6和MS培養基。在N 6和MS中均出現胚早熟萌發現象,部分子葉片發生卷曲,有愈傷組織出現,子葉柄有白色根毛長出。在N 6中胚出現愈傷組織的情況較多(39.06%),顯著高于MS和B 5。而在MS中胚的子葉柄生根現象較嚴重,根毛多,根須長,生根率高達47.40%(表1)。綜上可知,B 5培養基為油菜離體胚培養的最適培養基。

表1 不同培養基對離體培養胚的胚性生長的影響

注:圖中藍色圈內出現愈傷組織,紅色圈內出現生根,白色圈內兩者皆出現。

2.2 不同蔗糖濃度對油菜離體培養胚的胚性生長的影響

胚離體培養需要蔗糖作為碳源為其提供能源物質,同時蔗糖還能為離體培養的胚提供穩定的滲透壓來維持胚胎的正常生長和發育。由表2可見,隨著蔗糖濃度增加,胚的胚性生長率呈先升后降趨勢,8%時離體培養胚的胚性生長率最大,其他蔗糖濃度均低于8%。4%時離體培養胚容易早熟萌發成幼苗,子葉柄會有大量白色根毛產生,胚性生長率最低(79.76%),因此,最適蔗糖濃度為8%。

表2 不同蔗糖濃度對離體培養胚的胚性生長的影響

2.3 不同瓊脂濃度對油菜離體培養胚的胚性生長的影響

油菜種子在發育過程中尤其是在發育早期,未成熟種子的幼胚處于液態的胚乳中,胚生長的環境屬于一種半液態環境。為了探索這種半液態環境下的最適胚離體培養條件,在B 5+8%蔗糖的培養基基礎上設計了5個瓊脂濃度進行油菜胚離體培養。結果(表3)表明,隨著瓊脂濃度升高,離體培養胚的胚性生長率呈先升后降的趨勢,瓊脂濃度為0.6%時胚的胚性生長狀況最好,達92.19%。所以,選擇0.6%作為維持胚離體培養胚性生長的最適瓊脂濃度。

表3 不同瓊脂濃度對離體培養胚的胚性生長的影響

2.4 不同激素濃度配比對油菜離體培養胚的胚性生長的影響

油菜組織培養體系中,影響外植體生長發育的一個重要因素是培養基中外源激素的組成,本實驗在重新確定了最適蔗糖濃度(8%)和瓊脂濃度(6%)后的B 5培養基中,加入不同濃度配比的NAA和6-BA,探究兩種激素利于油菜胚離體培養最適濃度配比。結果顯示,胚離體培養10 d左右胚的子葉生長迅速,20 d時胚的子葉片均明顯增大、增厚且顏色變綠,子葉柄伸長且略有膨大,但也出現個別胚在接種后變黃、變褐或者停止生長現象,且不同配比組合離體培養胚的子葉片彎曲程度不同,子葉片顏色及子葉柄生長狀態也有所區別。與其他配比處理相比,P 7培養基中胚的胚性生長狀況最好,子葉片顏色較鮮綠,胚性生長率最高,達94.64%(表4)。綜合不同配比處理得到的胚性生長率,以P 7(0.05 mg/L NAA和0.15 mg/L 6-BA)激素配比作為胚離體培養胚性生長的最適濃度激素配比組合。

表4 不同激素濃度配比對離體培養胚的胚性生長的影響

3 討論與結論

培養基既是提供細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質,也是細胞生長和繁殖的生存環境。培養基種類很多,不同類型的培養基成分差異明顯,對甘藍型油菜胚離體培養所產生的影響也不同。本研究選用B 5、N 6和MS培養基進行甘藍型油菜幼胚離體培養,觀察其生長狀況。結果顯示,甘藍型油菜幼胚在B 5培養基上培養更利于胚的胚性生長,在N 6和MS培養基上胚性生長狀況較差,胚在非胚性生長狀態下更容易出現早熟萌發及生根現象,這種現象與培養基自身的營養物質組成密切相關。MS和N 6培養基都含有較高濃度的硝酸鹽和銨鹽,尤其是MS培養基,在不添加其他有機成分的情況下,無機養分的含量也足以滿足植物細胞生長發育營養需求,但甘藍型油菜幼胚更適宜在銨鹽含量較低及鉀鹽含量較高的培養基中維持其胚性生長。1968年,Gamborg等[9]在研究大豆根細胞時初次設計使用了B 5培養基,之后許多研究也表明B 5培養基是雙子葉植物離體培養最適培養基。于新杰[10]研究發現,B 5培養基中木蘭種子發芽率較高,褐化率最低,是最佳培養基;鄧林彬等[8]在甘藍型油菜胚離體培養研究中發現,B 5培養基中胚胎形態變化較小,基本維持胚性生長狀態,胚根出現生長延伸、長根毛的現象極少,更適合作為胚培養基礎培養基。本研究結果與之一致。綜上表明,B 5培養基是研究油菜胚離體培養胚性生長的最適培養基。

胚離體培養時對培養環境要求較高,胚在維持其胚性生長狀態時需要合適的滲透壓和穩定的能量來源及無菌環境。蔗糖除作為培養基內的主要碳源和能源外對維持培養基的滲透壓也起重要作用,不但為胚離體培養提供了生長發育所需能量,而且形成的滲透壓也能長時間保持相對穩定,不易造成細胞脫水而影響生長,也在一定程度上減少了微生物的污染。王蕓等[11]、張倩云等[12]研究表明,蔗糖濃度和滲透壓都制約著幼胚的胚性生長及萌發后的生長。所以,在胚離體培養中,幼胚離體培養需要人為創造一個較高的滲透壓環境來維持幼胚的胚性生長。Liu等[13]對兩個不同含油量的油菜品系的不同發育階段果皮和胚珠中的蔗糖濃度進行測定,結果發現,果皮蔗糖含量為3.98%～4.48%,胚珠蔗糖含量為5.26%～6.51%。Avjioglu等[7]通過甘藍型油菜幼胚培養研究發現,胚胎干重會隨著蔗糖濃度的增高而降低,當蔗糖濃度為2%時,幼胚早期萌發現象嚴重,當蔗糖濃度為10%時,幼胚早萌被抑制,維持其胚性生長。本實驗設置了5個蔗糖濃度梯度,最終確定了蔗糖濃度為8%時離體幼胚的胚性生長最好。但也發現過高的蔗糖濃度會造成培養基滲透壓失衡,導致幼胚脫水,影響其正常胚性生長。

油菜是雙子葉植物,具有無胚乳型種子,主要由胚和種皮兩部分構成。種子的胚乳在發育早期為液態,未成熟種子中的胚在這種由種皮包裹的半液態環境下以胚乳為養分不斷吸收胚乳進行生長發育,當種子成熟后胚乳便會消失[14-15]。所以為胚的正常生長發育創造一種相對的半液態環境對胚的生長發育至關重要。瓊脂作為一種很好的固化劑,瓊脂濃度不僅決定了培養基的軟硬程度及表層水分含量,也間接影響了這種人為創造的半液態環境下胚的生長發育狀況。本研究設置了5個瓊脂濃度梯度,通過胚生長狀況的測定確定了當培養基瓊脂濃度在0.6%時為最佳,此時胚能保持較好的胚性生長狀態。

自1937年,White在組織培養中加入IAA起,植物激素對組織培養的調控作用就引起了人類的廣泛關注。添加外源植物激素對離體培養外植體的細胞分化和形態建成有明顯的調節作用,而且不同種類的植物激素對植物外植體產生的效果不同。雖然植物本身就存在內源激素且激素水平會不斷發生變化,但外源植物激素的施加會直接影響和改變著外植體內源激素的水平,起到調控植物組織生長發育的作用。郭婷婷等[16]和楊長友等[17]研究也表明,植物外源激素在油菜組織培養中起著重要的作用。本試驗結果顯示,高濃度NAA不利于甘藍型油菜胚性生長,胚性生長對NAA的濃度較敏感;以0.05 mg/L NAA和0.1 mg/L 6-BA配比組合的培養基胚性生長狀況最好,胚性生長率最高(94.64%),更適宜作為胚離體培養的最佳激素濃度配比。

本研究表明,以B 5培養基+8%蔗糖+0.6%瓊脂+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA為甘藍型油菜胚離體培養最佳胚性生長體系,此條件下的離體幼胚維持胚性生長的狀況最好,胚性生長率高,達94.64%。本研究建立了甘藍型油菜胚性生長培養體系,為油菜胚性生長及種子含油量遺傳機制研究提供了理論基礎和技術支撐。