血小板衍生生長因子BB在川崎病血小板增多中的作用及機制研究

沈西偉 湯志遠 申嫻娟 趙建美

（1.南通大學附屬醫院兒內科，江蘇南通 226001；2.南通大學醫學院，江蘇南通 226001；3.南通大學附屬醫院藥劑科，江蘇南通 226001；4.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226001）

川崎?。↘awasaki disease，KD）常伴有血小板增多，好發于KD 第2～3 周。血小板升高增加冠狀動脈瘤血栓形成、心肌梗死和死亡的風險［1-2］。反應性血小板增多癥（reactive thrombocytosis，RT）指外周血中血小板計數＞450×109/L，最常見病因是感染和KD。RT 發病機制主要是血小板生成增加，主要與血小板生成素（thrombopoietin，TPO）升高有關［2-3］。但是，Ishiguro等［4］發現KD病程中血小板計數正常的患兒TPO水平高于健康對照組；在KD 第1 周血小板計數正常時，血清TPO 水平升高；當KD 第2 周血小板計數明顯升高達峰值時，TPO 水平沒有下降；KD 第3 周時TPO 水平與健康對照組相當。Miura 等［5］發現KD 患兒在起病第3周血小板計數明顯升高，TPO水平卻在第2周時下降。Alberio［6］發現RT 與TPO 之間沒有明顯相關性。這些研究［4-6］表明KD 患兒血小板增多的機制尚不清楚。

血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF） 成員包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD 等。其中，PDGF-BB 與血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）結合，促進造血干細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等增殖，而酪氨酸酶抑制劑如伊馬替尼能夠抑制PDGFR 活性［7］。PDGF-BB/PDGFR-β信號通路與造血系統關系密切。Kaminski等［8］證明敲除小鼠PDGF-BB和PDGFR-β基因可誘發血小板減少癥。楊默等［9］證實PDGF-BB/PDGFR-β 能促進造血干細胞增殖及血小板生成。周麗霞等［10］發現PDGF-BB/PDGFR-β 在原發性血小板增多癥中高表達。然而，目前關于KD患兒血小板增多的機制尚不明確。因此，本研究首先在臨床層面探究PDGF-BB 在KD 患兒急性期是否升高；其次，在動物層面驗證PDGF-BB在KD小鼠中的表達情況及其在血小板生成中的作用；最后，在細胞層面探究PDGF-BB對Dami細胞生成血小板的機制，為KD診治尋找新的策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年9 月—2022 年10 月我院兒內科住院的40 例KD 患兒為KD 組，其中男23 例（58%）、女17 例（42%）；年齡從3 個月至9 歲，平均年齡為（35±23）個月。納入標準：（1）符合KD 診斷標準［11］；（2）病程7 d以內；（3）靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）2 g/kg 單次治療后體溫正常；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）入院前接受IVIG、糖皮質激素、阿司匹林治療者；（2）腫瘤及免疫性疾病者。

選取同期在體檢中心體檢且無感染史的健康兒童40例為健康對照組，其中男26例（65%）、女14 例（35%）；年齡從1 個月至9 歲，平均年齡為（37±24）個月。兩組在年齡（t=0.438，P=0.662）、性別（χ2=0.474，P=0.491）上比較差異無統計學意義。本研究經我院倫理委員會批準（2018-K021）及家長簽署知情同意書。

1.2 細胞和試劑

Dami 細胞株（北納創聯生物科技有限公司，中國）；胎牛血清（北京沃卡威生物技術有限公司）；CCK-8 試劑（蘭杰柯科技有限公司，中國）；重組人PDGF-BB（PeproTech，美國）；伊馬替尼（上海畢得醫藥科技股份有限公司，中國）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡試劑盒、FITC 標記的抗小鼠CD41抗體（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， 中國）； FITC 標記的抗人CD61 抗體（eBioscience，美國）；人PDGF、小鼠PDGF-BB 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（上海源桔生物科技公司，中國）；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR 、ChamQ SYBR qPCR Master PCR（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國）；乙酰膽堿酯酶染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國）；兔抗人Akt、p-Akt及鼠抗人β-actin 抗體（Proteintech，美國）；山羊抗兔、山羊抗小鼠熒光二抗（Cell Signaling Technology，美國）。

1.3 ELISA檢測PDGF表達

收集KD組入院次日清晨和健康對照組兒童空腹全血3 mL，分離上清凍存于-80℃。ELISA 試劑盒常溫冷卻，按說明書操作，計算PDGF濃度。

1.4 實驗動物及分組

SPF 級3～4 周齡雄性C57BL/6 小鼠90 只［生產許可證號：SCXK（蘇）2020-0009，使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0046］，平均體重13～15 g，購于江蘇華創信諾醫藥科技公司，飼養溫度20～23℃，濕度50%～60%，12 h 明暗光交替，自由飲水與進食。獲南通大學倫理委員會批準（IACUC 20220829-1001）。適應性飼養1 周后將小鼠隨機分為3 組：正常組、KD 組和伊馬替尼組，每組各30只。

1.5 構建KD小鼠模型

參考Duong等［12］KD造模方法。KD組于第1天以干酪乳桿菌細胞壁提取物0.25 mL（0.5 mg）腹腔注射1次。伊馬替尼組于第1天以干酪乳桿菌細胞壁提取物 0.25 mL（0.5 mg）腹腔注射1 次，第2天起以伊馬替尼溶液（50 mg/kg）灌胃，1 次/d，持續27 d。正常組第1天腹腔注射等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），然后與KD組于第2 天起分別用等量PBS 灌胃，1 次/d，持續27 d。

1.6 心臟組織蘇木精-伊紅染色

第14 天每組隨機取5 只小鼠的心臟組織，經固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后，鏡下觀察心臟組織，使用Image J 軟件分析炎性細胞數量［13］。

1.7 小鼠血常規和細胞因子檢測

每組隨機取5 只小鼠分別于第0 天行眼眶取血，第3、7、14、21、28天摘眼球取血，將50 μL血樣置于抗凝管中，行血常規檢測；其余血樣離心收集血清，保存-80℃冰箱中，ELISA 檢測PDGF-BB及TNF-α。

1.8 小鼠骨髓巨核細胞集落形成單位培養及巨核細胞標記物CD41檢測

第21 天每組隨機取5 只小鼠頸椎脫臼法處死后，取雙側股骨，消毒后用5 mL 注射器吸取4 mL IMDM培養基沖洗骨髓腔，離心收集細胞。取骨髓細胞2×105/mL接種于6孔板中培養7 d（1 mL培養體系為IMDM 培養基0.6 mL、1%牛血清白蛋白0.1 mL、0.34 mg 氯化鈣、10% 牛血漿0.1 mL、50 ng/mL TPO 10 μL）。培養結束后干燥。每孔2 mL 1%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗后干燥。乙酰膽堿酯酶染色液室溫染色4 h 后以50%甲醇、PBS洗滌1次，鏡下計數骨髓巨核細胞集落形成單位（megakaryocyte colony forming unit，CFU-MK）。

CD41 是巨核細胞分化成熟標記物。取適量骨髓細胞，100 μL PBS 重懸，加入CD41 單抗5 μL，避光孵育20 min后上機檢測。

1.9 細胞培養

Dami 細胞種植于T25 培養瓶中，用含13%胎牛血清的RPMI-1640培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.10 CCK-8細胞增殖實驗

取對數生長期的Dami 細胞接種于96 孔板。PDGF-BB 按0、6.25、12.5、25、50、100 ng/mL 與細胞共培養，在24、48、72 h 時加入10 μL CCK-8試劑，孵育3 h 后酶標儀檢測450 nm 處吸光度值。實驗獨立重復至少3次。

1.11 血小板生成實驗及其標記物CD61檢測

將PDGF-BB按0、12.5、25、50、100 ng/mL與細胞共培養24 h，PDGF-BB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L 與細胞共培養24 h。800 r/min 離心10 min 收集上清，2 500 r/min 離心10 min 收集沉淀即血小板。100 μL PBS 重懸血小板后，用自動血液細胞分析儀檢測血小板數量。CD61 是血小板表面標記物。將PDGF-BB 按6.25、25、100 ng/mL 與細胞共培養24 h，用上述同樣方法收集血小板，加入CD61 單抗及同型抗體各0.25 μg，避光孵育20 min后上機檢測。實驗獨立重復至少3次。

本部分實驗分為對照組、KD 組和伊馬替尼組。對照組用含10%正常兒童血清的完全培養基培養；KD 組和伊馬替尼組用含10% KD 急性期患兒血清的完全培養基培養，后者同時添加伊馬替尼（20 μmol/L）。培養24 h后用上述同樣方法收集檢測血小板數量。實驗獨立重復至少3次。

1.12 實時定量PCR檢測PDGFR mRNA表達

本部分實驗分為對照組、PDGF-BB（25 ng/mL）組、伊馬替尼（20 μmol/L）組和聯合組（PDGFBB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L），培養細胞24 h后提取RNA。按逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，以其為模板，按PCR 試劑盒進行PCR 反應。 引物序列如下， PDGFR- α： 上游5'-GCTTGAAGGCA-GGCACATTTACATC-3'， 下游5'-AAGGTTACA-GGAGTCTCGGGATCAG-3'； PDGFRβ：上游5'-CCAGAAGCCATCAGCAGCAAGG-3'，下游5'-CGAGCAGGTCAGAACGAAGGTG-3'；β-actin：上游 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'， 下游 5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。采用2-ΔΔCt計算結果。實驗獨立重復至少3次。

1.13 Western blot檢測蛋白表達

本部分實驗分為對照組、PDGF-BB（25 ng/mL）組、伊馬替尼（20 μmol/L）組和聯合組（PDGFBB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L）。培養細胞24 h后RIPA 裂解液提取蛋白，通過SDS-PAGE 電泳將蛋白轉移至PVDF 膜上，快速封閉液室溫封閉10 min， 加入一抗Akt、 p-Akt （濃度均為1∶5 000）、β-actin（1∶10 000），4℃過夜。洗膜后室溫孵育熒光二抗（1∶10 000）1 h，洗膜后顯影。實驗獨立重復至少3次。

1.14 統計學分析

使用GraphPad Prism 10.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。相關性分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童血清PDGF與血常規指標比較

與健康對照組相比，KD 組血清PDGF-BB、白細胞計數、中性粒細胞絕對值及血小板計數增高（P＜0.001），紅細胞計數及血紅蛋白水平降低（P＜0.05）。兩組PDGF-AA、PDGF-CC、PDGF-DD水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組兒童血清PDGF與血常規指標比較 （± s）

表1 兩組兒童血清PDGF與血常規指標比較 （± s）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子；［KD］川崎病。

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2.2 KD 組患兒血清PDGF-BB 與血常規指標的相關性分析

KD組患兒急性期血清PDGF-BB與血小板計數呈正相關（r=0.397，P＜0.05），見表2。

表2 KD組患兒血清PDGF-BB與血常規指標的相關性分析（n=40）

2.3 小鼠冠狀動脈病理學變化

與正常組相比，KD 組冠狀動脈炎癥細胞數量增多（P＜0.001）；與KD 組相比，伊馬替尼組冠狀動脈炎癥細胞數量變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠冠狀動脈炎癥細胞數量比較 （± s，n=5）

表3 各組小鼠冠狀動脈炎癥細胞數量比較 （± s，n=5）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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2.4 小鼠血常規及血清細胞因子比較

與正常組相比，KD組白細胞計數第3、7、14天時升高（P＜0.05），血小板計數第7、14、21 天時升高（P＜0.001），紅細胞計數、血紅蛋白水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）。與KD組相比，伊馬替尼組白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白水平變化差異無統計學意義（P＞0.05），血小板計數第14、21天時降低（P＜0.001）。見表4～7。

表4 各組小鼠外周血白細胞計數比較 （± s，n=5，×109/L）

表4 各組小鼠外周血白細胞計數比較 （± s，n=5，×109/L）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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表5 各組小鼠外周血紅細胞計數比較 （± s，n=5，×1012/L）

表5 各組小鼠外周血紅細胞計數比較 （± s，n=5，×1012/L）

注：［KD］川崎病。

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表6 各組小鼠外周血血紅蛋白水平比較 （± s，n=5，g/L）

表6 各組小鼠外周血血紅蛋白水平比較 （± s，n=5，g/L）

注：［KD］川崎病。

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表7 各組小鼠外周血血小板計數比較 （± s，n=5，×109/L）

表7 各組小鼠外周血血小板計數比較 （± s，n=5，×109/L）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05；b示與KD組比較，P＜0.05。

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與正常組相比，KD 組第3、7、14、21 天時PDGF-BB、TNF-α濃度升高（P＜0.05）；與KD組相比，伊馬替尼組PDGF-BB、TNF-α 變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表8～9。

表8 各組小鼠血清PDGF-BB濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

表8 各組小鼠血清PDGF-BB濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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表9 各組小鼠血清TNF-α濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

表9 各組小鼠血清TNF-α濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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2.5 各組小鼠CFU-MK 及巨核細胞標記物CD41的比較

KD 組CFU-MK 數量高于正常組（P＜0.001），伊馬替尼組CFU-MK 數量低于KD 組（P＜0.001）。KD組CD41表達高于正常組（P＜0.001），伊馬替尼組CD41表達低于KD組（P＜0.001）。見表10。

表10 各組小鼠CFU-MK數量、CD41表達的比較（± s）

表10 各組小鼠CFU-MK數量、CD41表達的比較（± s）

注：［KD］川崎??；［CFU-MK］巨核細胞集落形成單位。a示與正常組比較，P＜0.001；b示與KD組比較，P＜0.001。

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2.6 PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響

PDGF-BB與Dami細胞共培養24、48、72 h后，PDGF-BB 對Dami 細胞的增殖作用與其濃度有關。24 h、72 h時PDGF-BB 25 ng/mL促進細胞增殖的作用最顯著（P＜0.05）；48 h 時PDGF-BB 25 ng/mL 促進細胞增殖的作用與PDGF-BB 12.5 ng/mL 相當，優于其他濃度組（P＜0.05）。見表11。

表11 不同濃度PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響（± s，n=5）

表11 不同濃度PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響（± s，n=5）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a示與0 ng/mL組比較，P＜0.05；b 示與6.25 ng/mL 組比較，P＜0.05；c 示與12.5 ng/mL 組比較，P＜0.05；d示與25 ng/mL組比較，P＜0.05。

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2.7 KD 急性期患兒血清與PDGF-BB 對血小板生成的影響

Dami 細胞單獨培養時，未檢測到血小板。與對照組相比，KD組血小板生成增加，加入伊馬替尼后血小板生成減少（P＜0.05）。不同濃度的PDGF-BB 可誘導Dami 細胞生成血小板，PDGF-BB 25 ng/mL 加入伊馬替尼后血小板生成減少（P＜0.001）。見表12～13。

表12 KD急性期患兒血清對血小板生成的影響（± s，n=5）

表12 KD急性期患兒血清對血小板生成的影響（± s，n=5）

注：［KD］川崎病。a 示與對照組比較，P＜0.001；b 示與KD組比較，P＜0.05。

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表13 PDGF-BB對血小板生成的影響 （± s，n=5）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a示與0 ng/mL組比較，P＜0.001；b示與25 ng/mL組比較，P＜0.001。

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2.8 PDGF-BB對血小板標記物CD61的影響

PDGF-BB 6.25、25、100 ng/mL 作用于Dami 細胞24 h后，CD61表達比例分別為（14.4±1.2）%、（25.3±4.4）%、（18.4±1.6）%，差異有統計學意義（F=11.850，P=0.008）。經組間兩兩比較，25 ng/mL 組CD61 表達比例高于6.25 ng/mL 組（P＜0.05）。

2.9 PDGF-BB 對Dami 細胞PDGFR mRNA 的影響

與對照組相比，PDGF-BB 組PDGFR-α mRNA表達無顯著變化（P＞0.05），PDGFR-β mRNA 表達增加，加入伊馬替尼后PDGFR-β mRNA 表達下調（P＜0.05），見表14。

表14 各組Dami細胞PDGFR mRNA相對表達量的比較（± s，n=3）

表14 各組Dami細胞PDGFR mRNA相對表達量的比較（± s，n=3）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子；［PDGFR］血小板衍生生長因子受體。a示與對照組比較，P＜0.05；b示與PDGF-BB組比較，P＜0.05。

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2.10 PDGF-BB 對Dami 細胞PI3K/Akt 通路的影響

與對照組相比，PDGF-BB組Akt蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），p-Akt 蛋白表達增加（P＜0.05）；與PDGF-BB組相比，聯合組Akt蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），p-Akt蛋白表達下調（P＜0.05）。見圖1、表15。

圖1 Western blot 檢測各組Dami 細胞中Akt、p-Akt蛋白表達電泳圖 1：對照組；2：PDGF-BB 組；3：伊馬替尼組；4：聯合組。

表15 各組Dami細胞Akt、p-Akt蛋白相對表達量的比較（± s，n=3）

表15 各組Dami細胞Akt、p-Akt蛋白相對表達量的比較（± s，n=3）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a 示與對照組比較，P＜0.05；b示與PDGF-BB組比較，P＜0.05。

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3 討論

本研究通過病例研究發現PDGF-BB在KD患兒急性期血清中高表達，與血小板計數呈正相關，提示PDGF-BB可能參與血小板生成。通過KD小鼠模型，證實PDGF-BB在KD小鼠中高表達，并促進CFU-MK形成、巨核細胞分化及血小板生成。通過細胞實驗證實Dami細胞在PDGF-BB誘導下高表達PDGFR-β mRNA 及p-Akt 蛋白，伊馬替尼抑制PDGFR-β 后，下調巨核細胞CD41、PDGFR-β mRNA 及p-Akt 蛋白表達，影響血小板生成。這與羅毅等［14］證實PDGF-BB在骨髓抑制小鼠模型中促進巨核細胞增殖和血小板生成的結論相符合。

PDGFR 屬于受體酪氨酸酶，受到刺激時表達增加［15］。Yang 等［16］證實Dami 細胞表達PDGFR-α和PDGFR-β。當PDGFR-α 和PDGFR-β 同時存在時，PDGF-BB優先與PDGFR-β結合［17］。研究發現PDGFR 抑制劑伊馬替尼可導致血小板減少［18］。機制可能是伊馬替尼抑制PDGFR-β，阻滯PI3K/Akt信號通路，影響巨核細胞增殖及血小板生成［19-20］。

盡管血小板計數升高反映KD炎癥與疾病的嚴重程度，但本研究發現抑制PDGFR 導致血小板計數減少并未減輕KD 炎癥，原因可能是KD 主要由異常的免疫激活、細胞因子風暴、內皮細胞損傷等多種因素引起［1］，而PDGF-BB/PDGFR 只是眾多細胞因子網絡通路中的一員，單獨抑制PDGFR 可能不會直接減輕KD冠狀動脈炎癥。

綜上所述，本研究通過體內外實驗，初步探究了PDGF-BB在KD血小板增多中的作用。PDGFBB 可能通過與PDGFR-β 結合，激活PI3K/Akt 通路，促進巨核細胞的增殖、分化，調節血小板的生成，而伊馬替尼能對抗PDGF-BB的促增殖作用、減少血小板的生成，這為KD的治療提供了一個新的靶點。本研究仍有不足之處，由于骨髓中的巨核細胞數量非常少，無法為實驗提供穩定的原代細胞來源，研究的借鑒意義相對受限；同時細胞之間的信號通路復雜有待進一步的研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。