聚合7OE亞基1B/1R易位系材料的創制及其品質研究

姚楚玄,張 磊,秘彩莉,周 碩,董福雙,劉永偉,楊 帆,焦 博,柴建芳

(1.河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所/河北省植物轉基因中心,河北石家莊 050051; 2.河北師范大學生命科學學院,河北石家莊 050024)

小麥1B/1R易位系由于1R染色體短臂(1RS)上攜帶有抗病、高產、廣適性等優良基因[1-2],在中國已得到廣泛應用[3-5],但其加工品質不佳,主要體現在面筋強度低、耐揉性差和面團發粘,因此不適合加工優質面包和優質面條[6-7]。原因可能是1RS攜帶的黑麥堿基因編碼的ω-黑麥堿和γ-黑麥堿[8]均為單體蛋白,其中ω-黑麥堿極易溶于水。

小麥高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)分別由1A、1B和1D染色體長臂上的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點編碼。研究表明,Glu-D1位點編碼的5+10優質亞基取代等位變異2+12亞基后,可在一定程度上提高1B/1R易位系的加工品質[9-10]。但僅靠導入5+10優質亞基提高小麥加工品質的幅度有限。Glu-B1位點編碼的超表達7OE亞基是另一個重要的優質亞基,該亞基在國外應用相對較多[11],在國內強筋春小麥育種中也有應用[12],但在改善小麥1B/1R易位系品質方面尚未見報道。

麥谷蛋白溶脹指數(swelling index of glutenin, SIG)作為反映小麥品質的一個參數,測定時僅需要少量的面粉或全粉[13-14]。乳酸-SDS溶劑保持力(lactic acid-sodium dodecyl sulfate solvent retention capacity,LA-SDS SRC)是軟質小麥品質的特有參數,其反映軟質小麥的優劣,測定時面粉或全粉用量較多,但重復性較好,適合對早代材料進行品質預測[15]。SDS沉降值能體現小麥烘烤品質的好壞,測定時需要樣品量也較少[16]。本研究選用小麥1B/1R易位系品種科農199為母本,與含有7OE亞基的強筋春小麥品種津強6號雜交,從后代中篩選出黑麥堿基因與7OE亞基基因聚合在同一條染色體上的1B/1R易位系材料,然后通過SIG、LA-SDS SRC和SDS沉降值測定,初步了解這種聚合材料的品質情況,以期為今后更好利用1B/1R易位系提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及種植

供試材料包括科農199(母本)、津強6號(父本)及其雜交后代。其中,科農199為中筋冬小麥品種,含1B/1R易位,其HMW-GS組成為1/7+9/2+12;津強6號為強筋春小麥品種,不含1B/1R易位,其HMW-GS組成為1/7OE+8*/5+10;雜交后代選用7+9和7OE+8*亞基基因之間發生替換的F4代單株及其后代。F4代種子播種于玻璃溫室,溫度控制在18～25℃,每天光照16 h;F5代種子播種于大田,種成株行,常規大田管理。

1.2 DNA提取及PCR擴增

用天根生化科技有限公司(北京)生產的植物基因組DNA小量提取試劑盒提取小麥葉片的基因組DNA,使用北京GenStar公司(北京)生產的StarMix,在BIO-RAD S1000TMPCR儀中進行PCR擴增。雜交后代黑麥堿基因的純合性檢測按照Chai等[17]的方法進行;5亞基基因的純合性檢測按照Ishikawa等[18]的方法進行;7OE亞基基因的純合性檢測使用Bx7OE標記[19],9亞基基因的純合性檢測使用By9標記[20]。選用位于1BL的4個SSR標記Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582[21-22]檢測7OE亞基發生聚合的位點。所用的標記信息見表1。

表1 本研究所用的標記引物信息Table 1 Primers of markers used in this study

1.3 麥谷蛋白溶脹指數(SIG)的測定

用FOSS旋風磨(帶有1 mm的不銹鋼濾網)將小麥籽粒磨成全粉,按照Wang等[13]的方法進行SIG測定,略有改動。具體步驟:稱取40 mg全粉置于稱重的2 mL離心管中,加入0.6 mL蒸餾水,在旋渦震蕩器中(1 400 r·min-1) 水化20 min,然后再加入0.6 mL SDS-乳酸溶液[2% SDS溶液∶乳酸儲液(85%乳酸用蒸餾水稀釋8倍后加熱回流6 h) = 48∶1]混合5 min,使其溶脹,然后300 g離心5 min后,去掉上清液,離心管再300 g離心2 min后,倒置20 min,然后稱取整個離心管的重量。離心管中殘留物質的重量與面粉重量的比值即為SIG值。每個樣品重復測定3次。

1.4 微量SDS沉降值的測定

按照Dick等[16]的方法進行SDS沉降值測定,略有改動。具體步驟:每個樣品稱取0.5 g小麥全粉,置于10 mL具塞刻度試管中,然后加入2 mL溴酚蘭水溶液(10 mg·L-1),用渦旋震蕩器混合20 s,靜置5 min,再渦旋震蕩混合10 s,再靜置5 min后,立即向混合后的樣品中加入6 mL SDS-乳酸混合溶液,上下顛倒10次后,迅速豎立于小麥SDS沉淀值測定儀試管架上放置10 min,快速準確讀取沉降值。每個樣品重復測試3次。

1.5 乳酸-SDS溶劑保持力(LA-SDS SRC)的測定

采用Seabourn等[15]的方法測定小麥全粉的LA-SDS SRC。具體步驟:取25 mL 85%的乳酸溶液加入至200 mL蒸餾水中,將該儲液加熱回流6 h,以減少乳酸分子的聚集趨勢,然后將乳酸儲液與蒸餾水按1∶19 的比例混合為“乳酸工作液”。稱量1.0 g小麥全粉,放入提前稱重的50 mL離心管中,加入5 mL乳酸工作液,用渦旋震蕩儀混合6 s,然后加入20 mL 1.25% 的SDS溶液,再次用渦旋震蕩儀混合6 s。然后將離心管在搖床上搖動4 min (300 r·min-1,23 ℃),3 200 g離心2 min后,去掉上清液,倒置在吸水紙上,靜置20 min后稱取整個離心管的重量。每個樣品重復測定3次。計算公式如下:SRC=[(沉降物重量/面粉重量)×86/(100-面粉含水量)-1]×100%。面粉含水量采用HM-105L鹵素水份分析儀進行測定。

1.6 統計分析

用DPS 9.01軟件對測定結果進行方差分析和差異顯著性比較(Duncan法)。

2 結果與分析

2.1 聚合7OE亞基1B/1R易位系材料創制結果

1B/1R易位系中筋小麥品種科農199與非1B/1R易位系強筋小麥品種津強6號雜交,從F2代開始對農藝性狀表現優良的后代進行HMW-GS組成檢測,發現30個F3代植株中,有3個植株黑麥堿基因純合而7OE亞基基因雜合,1個植株7OE亞基基因純合而黑麥堿基因雜合,說明這些植株中發生了7OE亞基基因與黑麥堿基因之間的聚合。為獲得純合聚合體,進一步對黑麥堿基因純合而7OE亞基基因雜合植株的F4代分離群體進行PCR檢測,發現被檢測的44個植株中,7OE亞基基因與黑麥堿基因均純合的聚合植株7株,雜合聚合植株27株,純合非聚合植株10株。圖1展示了3個純合聚合植株和3個非聚合植株及其親本中黑麥堿基因以及Glu-B1位點7OE和9亞基基因的PCR檢測結果。由于這6個后代植株的黑麥堿基因已經純合,所以只擴出了1條1 076 bp的特異條帶(圖1A)。在Glu-B1位點,含有7OE亞基的3個聚合植株和親本津強6號擴增出7OE亞基基因特異的844 bp條帶(圖1B);而含有9亞基的3個非聚合植株和親本科農199擴增出9亞基基因特異的662 bp條帶(圖1C),3個聚合植株沒有擴出662 bp的特異條帶,說明聚合植株中7OE和8*亞基仍連鎖在一起。在Glu-D1位點,這3個純合聚合植株和3個非聚合植株只擴增出了5亞基基因特異的320 bp條帶,而沒有擴出2亞基基因特異的361 bp條帶(圖2),說明聚合植株和非聚合植株在Glu-D1位點均攜帶5亞基基因。在Glu-A1位點,由于兩個親本均攜帶1亞基,所以聚合植株和非聚合植株在該位點仍均攜帶1亞基基因。綜合3個亞基基因的PCR檢測結果,說明這6個F4代植株除了在Glu-B1位點有差異外,在Glu-A1和Glu-D1位點上沒有差異。

A:黑麥堿基因的檢測結果;B:Glu-B1位點7OE亞基基因的檢測結果;C:Glu-B1位點9亞基基因的檢測結果。M:DL2000;H:陰性對照(H2O);P1:津強6號(父本);P2:科農199(母本);1～3:7OE亞基基因與黑麥堿基因未聚合植株;4～6:7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合植株,圖2和圖3同。A: PCR results of secalin gene; B: PCR results of 7OE subunit gene at Glu-B1 locus; C: PCR results of 9 subunit gene at Glu-B1 locus. M: DL2000; H: Negative control(H2O); P1: Jinqiang 6(male parent); P2: Kenong 199(female parent); 1-3: 1B/1R translocation plants without pyramiding 7OE subunit; 4-6: 1B/1R translocation plants with pyramiding 7OE subunit. The same in figures 2 and 3.圖1 F4代部分聚合和未聚合植株中黑麥堿基因和Glu-B1位點7OE亞基基因的PCR檢測Fig.1 PCR result of secalin gene and 7OE subunit gene at Glu-B1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation

圖2 F4代部分聚合和未聚合植株中Glu-D1位點5亞基基因的PCR檢測Fig.2 PCR result of 5 subunit gene at Glu-D1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation

2.2 7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合位點的確定

為確定7OE亞基基因與黑麥堿基因發生聚合的位置,首先對1B染色體長臂上的4個SSR標記Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582在2個親本間的多態性進行檢測,發現Xgwm259和Xgwm582在親本間具有多態性。進一步利用這2個標記對6個后代植株(3個純合聚合植株,3個非聚合植株)進行檢測,發現這6個植株與親本科農199具有相同的擴增帶型(圖3A, 3B),說明這2個SSR位點均來自科農199。由于7OE亞基基因位于這2個SSR標記之間[20],因此可以確定7OE亞基基因與黑麥堿基因聚合的位置在1B染色體長臂上,科農199的7+9亞基基因片段被津強6號的7OE+8*亞基基因片段所取代。

A:Xgwm582標記的檢測結果;B:Xgwm259標記的檢測結果。A:Detection results of Xgwm582 marker; B: Detection results of Xgwm259 marker.圖3 F4代部分聚合和未聚合株系的SSR檢測結果Fig.3 SSR detection results of some plants with and without pyramiding in F4 generation

2.3 聚合7OE亞基1B/1R易位系的品質

為明確聚合7OE亞基1B/1R易位系的品質,對溫室種植的聚合和未聚合7OE亞基的1B/1R易位系植株及其親本進行了SIG測定(表2),發現在1B/1R易位系中,用5+10優質亞基取代2+12亞基后(表2中的1、2和3號植株),SIG值顯著高于不含5+10優質亞基的親本科農199,但仍顯著低于親本津強6號;在聚合5+10優質亞基的基礎上再引入7OE優質亞基后(表1中的4、5和6號植株),4號和5號植株的SIG值進一步顯著提高,而且與津強6號相當,說明這2個植株中1B/1R易位系的品質劣變得到了完全的彌補。

表2 F4代部分聚合和未聚合植株及其親本的麥谷蛋白溶脹指數Table 2 SIG of some plants with and without pyramiding in F4 generation and their parents

為進一步驗證上述結果,把F4代聚合和未聚合7OE亞基的1B/1R易位系及其親本單株收獲的種子播種于大田,成熟后收獲株行的種子進行LA-SDS SRC和SDS沉降值的測定(表3),發現在1B/1R易位系中,用5+10優質亞基取代2+12亞基后,LA-SDS SRC和SDS沉降值仍顯著高于不含5+10優質亞基的親本科農199(除F2-34-52-27-43株系的SDS沉降值與科農199無顯著差異外);在聚合5+10優質亞基的基礎上再引入7OE優質亞基后,這些株系的LA-SDS SRC和SDS沉降值又進一步顯著提高,但并未達到強筋親本津強6號的水平。2個種植環境的結果說明,聚合5+10和7OE優質亞基的1B/1R易位系材料的加工品質顯著高于只聚合5+10優質亞基的1B/1R易位系材料。因此,聚合7OE亞基可顯著提高1B/1R易位系的加工品質。

表3 F5代部分聚合和未聚合株系及其親本的乳酸-SDS溶劑保持力和SDS沉降值Table 3 LA-SDS SRC and SDS sedimentation value of some lines with and without pyramiding in F5 generation and their parents

3 討論

小麥1B/1R易位系具有比較發達的根系,在中國干旱地區發揮了較大的作用。但由于1B/1R易位系的加工品質較差[6-7],在小麥品質育種中,常作為被淘汰的對象[23],如何提高小麥1B/1R易位系的品質仍面臨較大挑戰。

導入優質亞基是提高小麥1B/1R易位系加工品質的一個重要途徑。本研究向小麥1B/1R易位系中不僅導入了5+10優質亞基基因,而且還導入了7OE優質亞基基因,與不含優質亞基的親本科農199相比,只導入5+10優質亞基基因可以顯著提高1B/1R易位系的品質,這與申小勇[10]的報道一致。本研究在聚合5+10優質亞基的基礎上進一步聚合7OE優質亞基,發現1B/1R易位系的品質又得到了顯著提升,但與含有5+10和7OE優質亞基的非1B/1R易位系親本津強6號相比,仍存在明顯差距。

7OE亞基之所以表現優質是由于它包含2個有功能的7亞基[19],增加的1個7亞基可以提高籽粒麥谷蛋白總量和面筋強度[24]。7OE作為一個對農藝性狀沒有不良影響的優質亞基[25],在中國冬小麥育種中還沒有被利用,與5+10優質亞基聚合是提高小麥1B/1R易位系加工品質的重要育種方向。另外,用離子束誘變創造的黑麥堿位點缺失突變體在常規小麥育種中可以直接利用,但其白粉病抗性降低[26]。利用7OE亞基來提高小麥1B/1R易位系的品質可有效避免這種問題。

本研究得到的聚合7OE亞基的1B/1R易位系材料,盡管其加工品質達不到強筋親本津強6號的水平,但與中筋親本科農199比較,加工品質已有顯著提高,這些材料是否適合加工優質面條、餃子、饅頭等食品,還有待種子量足夠時進行全面的品質測定。