高效液相色譜化學發光法檢測魚肉中三種四環素類藥物

王麗娟，張 驪，余 穎，姜琳琳，劉海新，田盟盟

(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀 100081；3.集美大學，福建 廈門 361021)

四環素類藥物作為廣譜抗生素，因其價格便宜，目前仍被廣泛應用于畜禽、水生生物等產業領域，但若不合理地使用該類藥物，導致在動物源性食品中的殘留，會對消費者產生毒副作用[1-2]，因此開展四環素類藥物殘留的分析和監測研究工作對于保護人類健康及環境有一定的幫助。為保障食品安全和人類健康，我國三部委聯合發布的食品安全國家標準GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]中規定，四環素(Tetracycline，TC)、金霉素(Chlorotetracycline，CTC)每日允許攝入量為0～30 μg/kg，二者在魚肉中單個或組合的最大殘留限量為200 μg/kg；多西環素(Doxycycline hyclate，DTC)每日允許攝入量為0～3 μg/kg，在魚肉中最大殘留限量為100 μg/kg。

通過對四環素類藥物理化性質的研究，已經建立了多種檢測四環素類藥物殘留的分析方法[4-6]，主要有熒光法、紫外分光光度法、質譜法和化學發光法等。質譜法具有精密度高、可同時進行多種藥物檢測等優點，但是也存在儀器昂貴、檢測成本較高等不足。紫外分光光度法方法比較簡單，但是存在檢測靈敏度低、基質雜質干擾大等問題；在一定pH值范圍內，四環素類抗生素及其部分衍生物能產生熒光，并且一些螯合物的熒光強度比四環素類抗生素強，因此其可用于熒光檢測。目前利用四環素類天然熒光進行的檢測因靈敏度較低而較少被采用，多對其進行與金屬離子的絡合衍生，從而顯著提高檢測靈敏度，但是其需進行柱前衍生，且對pH等條件要求較高[7]?；瘜W發光分析法[8-9]因便于操作、分析快速、靈敏度高、線性范圍寬等顯著優點而受到青睞，其中近年來納米二氧化鈦(nano TiO2)因光致強氧化性而受到關注[10-11]。

目前納米TiO2的光催化氧化還原性質較少被應用于化學檢測領域，因此本文嘗試利用具有光致強氧化性且價廉環保的納米TiO2代替傳統的化學發光氧化試劑，對四環素類藥物進行檢測，以TC、CTC和DTC為分析對象，進行光催化條件的優化，并應用于實際樣品的檢測，以期滿足低成本環保檢測要求。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有LC-20AD色譜泵(日本島津公司)；低壓汞燈(253.7 nm，40 W，浙江新源照明電器公司)；鍍有納米TiO2的玻璃纖維(0.3 mm O.D.)固定在石英管中(150 mm × 0.8 mm I.D.)，6根石英管相互連接，使之平行環繞于低壓汞燈，并以鋁箔包裹，以充分利用紫外光(圖1a)；IFFL-E流動注射化學發光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；SX3-4-10A型纖維電阻爐(天津中環實驗電爐有限公司)；AB204-E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Milli-Q Academic去離子水發生器(上海百微生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑

鹽酸四環素、鹽酸金霉素和鹽酸多西環素對照品，純度≥95%，上海生物工程技術服務有限公司；甲醇(色譜純)﹑乙腈(色譜純)，美國Merck公司；亞鐵(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司，溶液臨用前配制并通氮氣除氧；魯米諾，純度為97%，美國Sigma公司；8～10 nm銳鈦型TiO2，上海江滬鈦白有限公司；其余試劑皆為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；所用水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備液：精密稱取鹽酸四環素、鹽酸金霉素和鹽酸多西環素對照品各10 mg，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備液(避光保存)；精密量取各儲備液適量，用甲醇稀釋至濃度分別為100 μg/mL、10 μg/mL的混合標準工作液，臨用前現配。

1.3.2 樣品采集與制備

實驗草魚樣品來自當地市場，經檢測，無藥物殘留。將草魚去頭、骨、內臟，取肌肉、魚皮等可食部分均質勻漿，置于-20℃冷凍保存備用。

1.3.3 樣品前處理

稱取試樣(5±0.05)g置于50 mL離心管中，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，中速振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液；下層再用10 mL乙酸乙酯重復提取1次；合并提取液，于40°C水浴旋蒸至干。加1 mL 0.01 mol/L稀鹽酸溶液溶解殘留物，再加入2 mL正己烷渦旋混勻，以4 000 r/min離心3 min，取下層液，經0.45 μm濾膜過濾，上機測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS C18柱(250 mm×2.0 mm，粒徑5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(氨水調節至pH 2.6)(30∶70，V/V)；流速0.2 mL/min；柱溫：25℃；進樣量100 μL。

1.3.5 TiO2涂層的制作方法

在玻璃纖維表面固定TiO2前，先要進行玻璃纖維的前處理，以去除表面的污物，避免在鍍膜過程中造成開裂和脫落。100 mg商業TiO2納米顆粒(8～10 nm)懸浮于50 mL水中，加入1 mL乙酰丙酮以防止納米顆粒的團聚，然后加入0.4 mL曲拉通X-100，作為膠體展開劑[12]。被分散的納米TiO2膠體溶液用膠頭滴管負載于處理后干凈、干燥的玻璃纖維表面[13]，然后對其進行80℃、30 min干燥。重復操作7次后，在馬弗爐中以2℃/min升溫到200℃煅燒2 h。

1.3.6 檢測流程

新配制的0.3 mg/L亞鐵溶液以0.8 mL/min流速和色譜分離后的TCs樣品混合，流經TiO2光反應器的0.625‰甲酸溶液和3×10-4mol/L魯米諾(pH=10.0)形成的混合液與TCs樣品混合后，所產生的化學發光信號被化學發光分析儀檢測，流程圖見圖1b。

1.3.7 標準曲線的制備

精密量取適宜濃度的四環素類標準工作液，用水稀釋成濃度為0.5、1、2、5、10、20和50 mg/L的系列標準溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，供儀器測定。以測得的峰面積為縱坐標、對應的標準溶液濃度為橫坐標、繪制標準曲線，并計算回歸方程和線性相關系數。

1.3.8 方法靈敏度、準確度及精密度的測定

按1.3.4項樣品前處理方法處理樣品，再按1.3.5項液相色譜條件和1.3.7項檢測流程進行分析測定。以信噪比S/N≥3為檢測限、S/N≥10為定量限。取空白魚肉樣品，添加3個不同濃度(定量限、500 μg/kg、1 000 μg/kg)混合標準工作液。每個濃度5個樣品平行實驗，重復3次，按照樣品前處理方法處理后，上機測定，計算回收率、批內和批間變異系數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性范圍

圖2所示為魚肉樣中四環素類藥物的色譜分離圖，在最佳實驗條件下，四環素類藥物標準曲線參數如表1所示，TC、CTC和DTC的濃度在0.5～50 mg/L范圍內與化學發光信號呈良好的線性關系。

表1 HPLC-nano TiO2-CL體系用于四環素類抗生素的分析參數

2.2 方法靈敏度、準確度及精密度

按照1.3.4中所述方法進行處理，空白魚肉中TC、CTC、DTC定量限分別為10.0、30.0和10.0 μg/kg。HPLC-nano TiO2-CL體系應用于檢測魚肉中四環素類藥物，計算的回收率及分析結果如表2所示。

表2 四環素類抗生素在魚肉樣品中的回收率(n=5)

3 討論與結論

3.1 檢測條件的優化

3.1.1 光催化條件的優化

為提高檢測靈敏度，從優化化學發光反應條件和光催化兩個方面進行考察。在光催化條件下，緩沖溶液對于獲得穩定可靠的化學發光信號有一定的影響。本實驗對不同緩沖溶液(碳酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽)進行了考察，以磷酸鹽為緩沖溶液時，可獲得最佳化學發光信號和信噪比，可能機理是相對于碳酸鹽等其他緩沖鹽，在紫外光照過程中磷酸根與OH·結合速率較低[14]，導致溶液中存在相對多的活躍自由基，造成氧化性相對較強。本文對磷酸鹽緩沖溶液的濃度也進行了考察，當磷酸鹽濃度范圍為0.05～0.8 mol/L時，隨著磷酸鹽濃度增加，TC化學發光的信號升高，但其濃度過高會使基線波動較大，因此磷酸鹽的濃度選擇0.2 mol/L?？疾炝姿猁}緩沖溶液在pH值6.0～10.0范圍內對實驗的影響，當pH為8.0～9.0之間時，化學發光信號最強且比較穩定，因此本實驗中所選磷酸鹽緩沖溶液的pH為8.2。

如圖3所示，以TC為考察對象，當沒有甲酸時，背景信號和TC檢測信號均較低(圖3a)。當通入甲酸時，背景信號和TC的化學發光信號顯著增強(圖3b)。對甲酸含量也進行了優化，最佳含量為0.625‰。相對緩沖鹽溶液，甲酸的加入會有更多的活性氧產生，使H2O2含量顯著升高[15]，從而造成背景升高和信號靈敏度的提高。但是當甲酸含量過高時，會造成過多甲酸被吸附于TiO2表面，使光催化效率降低，活性氧減少，從而造成信號的降低。

本研究也對混合管的長度(0～5 m)進行了考察，通過考察可知，化學發光信號隨著混合管長度的增加而增強，為同時獲得最佳化學發光信號和最佳分離度，最終所選擇混合管路的長度為2 m。

3.1.2 化學發光條件的優化

已知一些過渡金屬離子會對魯米諾化學發光反應具有催化作用，本實驗Fe3+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+均對化學發光信號具有增強作用，Fe2+對化學發光增強效果較好，由已知文獻報道可推測Fe2+與TiO2光催化甲酸溶液生成的H2O2快速反應，生成具有強氧化性的OH·，OH·再與H2O2反應生成超氧化物[16]，從而氧化魯米諾生成3-氨基鄰苯二甲酸鹽，產生強烈的化學發光信號，而且Fe2+與四環素類藥物的絡合常數僅低于Fe3+與四環素的絡合常數[17]，因此本實驗選擇Fe2+?？疾霧e2+濃度對化學發光信號的影響，當Fe2+濃度低于0.3 mg/L時，基線較低造成信號響應變差；當Fe2+濃度高于0.35 mg/L時，隨著濃度增加，信號逐漸降低；當在Fe2+溶液中加入1.0 mol/L NaCl時，信號有一定增強，可能是NaCl增強了溶液的離子強度，有利于反應向金屬離子和TC絡合方向進行[18]。

本文還研究了魯米諾濃度及其pH值對四環素化學發光檢測信號的影響，隨著魯米諾濃度增強，信號逐漸增強，當魯米諾濃度高于3×10-4mol/L時，其信號不再增強且化學發光的信號較不穩定，因此選擇的魯米諾濃度為3×10-4mol/L。在此條件下，魯米諾最佳pH為10.0，當pH大于11.0時信號降低。

3.2 色譜分離條件的優化

流動相組成的選擇是獲得良好的色譜峰形和最佳化學發光信號的關鍵因素。四環素類藥物在弱酸條件下比較穩定，為避免四環素類藥物與金屬離子的螯合和硅羥基的作用，選擇緩沖溶液為磷酸二氫鹽，流動相pH為2.6。有機溶劑的比例對化學發光信號也有一定的影響，乙腈的比例高于30%會對化學發光的信號產生比較強的淬滅作用；但是當乙腈的比例較低時，色譜分離時間變長，而且色譜峰形變寬甚至重疊，因此選擇的乙腈比例為30%。

3.3 可能的機理

TiO2+UV light → e-+h+

(1)

(2)

h++H2O →H++ ·OH

(3)

h++OH-→·OH

(4)

·OH+·OH → H2O2

(5)

由此可知，背景信號的產生來自于紫外光照TiO2產生的活性氧如H2O2等、氧化魯米諾產生的化學發光；當甲酸引入TiO2體系時，光生空穴氧化吸附于其表面的甲酸有更多的活性氧生成[14]，因而造成化學發光背景信號增強。Fe2+與TiO2光催化產生的活性氧快速反應，生成氧化性更強的·OH，從而具有較強的催化作用，而四環素類藥物與Fe2+形成絡合物，造成化學發光信號降低，降低量與四環素類藥物濃度成比例，進而對四環素類藥物進行定量檢測。

本方法聯用色譜和化學發光，實現同時分離檢測四環素類藥物，首先其靈敏度可滿足生物樣品如魚肉中四環素類藥物的檢測要求；其次此法成本較低；最后減少了化學試劑的使用，從而避免對環境的污染，為試劑開發提供了一種思路，同時為動物源食品中四環素類藥物檢測建立了新的方法。