杏鮑菇液體發酵沛縣黃皮牛蒡對多糖含量影響的研究

董玉瑋，朱曹凱，顧鑫玥，李 超，馮星星，胡傳銀，秦琰琪

（1. 徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018；2. 徐州天馬敬安食品有限公司，江蘇徐州 221747；3. 沛縣農業農村局，江蘇 徐州 221600）

牛蒡是菊科兩年生植物，也被人們稱為蒡翁菜，主要種植于北歐和中國浙江、河北以北、江蘇江北及東北等地區[1]。牛蒡中含有蛋白質、礦物質、纖維素、糖類，以及各種氨基酸和維生素，具有較高的營養價值[2]。同時，牛蒡根還具有較好的藥用功能，能降血脂、降血壓、清理腸道、增強人體調節免疫能力[3-4]。

杏鮑菇（Pleurotus abalone） 又名刺芹側耳，屬無隔擔子菌亞綱、傘菌目、側耳科、側耳屬。杏鮑菇因其口感和鮑魚類似，且有著杏仁的香味而得名[5]。杏鮑菇多分布于歐洲、非洲的北部和亞洲的部分地區。杏鮑菇營養組分豐富，含有人體所需的微量元素，其營養成分主要有糖類、蛋白質、礦物質元素等，能有效調節機體代謝水平，改善機體性能[6]。其中，杏鮑菇多糖作為杏鮑菇的主要提取物之一，可以有效提高機體免疫力，促進機體對營養物質均衡吸收，對病菌、腫瘤等有較強地抑制作用[7-8]。

液體發酵技術作為現代生物技術的重要組分之一，是利用微生物生長速度快、生長所需條件簡單等特點，使微生物在合適的條件下大量生產、繁殖、代謝，生產出人們所需求的菌株或代謝中產物的過程[9]。其中，食用菌液體發酵與固體發酵相比，產量較高、成本更低、發酵周期短，具有更高的經濟效益[10]。

牛蒡根中含有大量纖維素，同時含有蛋白質、礦物質、維生素，少量的綠原酸、多糖。微生物，尤其是一些藥食真菌，比如營養、保健價值較高的杏鮑菇、靈芝、毛木耳、茶樹菇等，具有分解、利用纖維素的能力，牛蒡中含有的蛋白質、維生素、礦物質等也可作為菌種生長提供營養成分，有助于充分利用牛蒡、食用菌等資源。該研究采用牛蒡根作為培養基，以杏鮑菇液體發酵牛蒡根，提取并檢測發酵液中的多糖，探討影響多糖含量的因素，為牛蒡、藥食真菌精深加工提供了技術支撐，具有較好的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料和試劑

沛縣黃皮牛蒡，徐州天馬敬安食品有限公司提供；杏鮑菇菌種，實驗室保存的高活性杏鮑菇菌種。

葡萄糖、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂、濃硫酸、95%乙醇等試劑，南京晚晴化玻儀器有限公司提供。

1.1.2 試驗儀器

HBT-DV24-566B 型蒸汽滅菌鍋，華東強劍工業裝備公司產品；FGY-856YU 型冰箱徐州美的電器產品；DC14962 型電子天平，南通南方六島貿易有限責任公司產品；LL.R98.402-H-II 型恒溫培養箱，上海富強儀器制造公司產品；GH-XC-5P 型潔凈紫外工作臺，無錫純潔設備有限責任公司產品；F48692型可見分光光度計，江蘇山岳科技有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配方

PDA 培養基：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.3%KH2PO4，0.3%酵母膏，0.15%MgSO4，2%瓊脂。

牛蒡液體培養基：1%～5%去皮牛蒡塊，大小0.1～0.2 cm3，1%酵母膏，按比例加水配制，高壓滅菌后備用。

1.2.2 菌種的活化與液體培養

使用PDA 培養基活化杏鮑菇菌種，于27 ℃下恒溫培養6 d。

液體培養：將活化后的杏鮑菇菌株接種到配置好的牛蒡液體培養基中，置于28 ℃條件下，以轉速120 r/min 培養5～7 d。

1.2.3 單因素試驗

為研究牛蒡液體培養基對發酵杏鮑菇菌株的影響，該試驗設計3 個單因素，分別為牛蒡含量、溫度、裝液量，主要考查各因素對杏鮑菇多糖的產量的影響，試驗做3 次，取平均值。

（1） 牛蒡含量。分別向裝有100 mL 牛蒡液體培養基的三角瓶中加入1%，2%，3%，4%，5%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在28 ℃搖床中以轉速120 r/min 培養5～7 d。

（2） 溫度。5 個裝有100 mL 牛蒡液體培養基的三角瓶中，均含有質量體積比3%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，分別放入溫度為24，26，28，30，32 ℃的搖床中，以轉速120 r/min 培養5～7 d。

（3） 裝液量。向5 個三角瓶中分別加入60，80，100，120，140 mL 的質量體積比3%的牛蒡液體培養基，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在溫度為28 ℃的搖床中，以轉速120 r/min 培養5～7 d。

1.2.4 響應面試驗設計

在單因素試驗后，取最優結果及附近的一共3 組數據，使用Design Expert 8.05b 軟件，設計方案，并按照軟件給出的方案進行試驗，得出結果。

試驗的因素與水平設計見表1。

表1 試驗的因素與水平設計

1.2.5 多糖的提取及測定[11-12]

（1） 粗多糖的提取方法。將發酵完成的培養基離心取上清，置于50 ℃的烘箱中濃縮至原體積的1/5，向其中加入5 倍體積的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中過夜，次日離心取沉淀，烘干后所得即為杏鮑菇粗多糖。

（2） 粗多糖的純化。將杏鮑菇多糖的粗提物用10 mL 純水溶解，并向其中加入多糖溶液體積1/4～1/3 的Sevag 試劑（氯仿- 正丁醇4∶1 的混合液），將其倒入分液漏斗中，上下振蕩15～20 min 后，靜置分層，倒出下層廢液，將上清液以轉速4 000 r/min離心15 min，取上清液，重復上述操作，直至沒有蛋白質析出，將上清液收集備用。

取一段截流分子量為6 000～8 000 的半透膜袋，置于沸水鍋中煮5 min，用純水將半透膜沖開，封住半透膜一側，將收集的上清液倒入其中，將另一端也封好，將處理好的透析袋懸掛于裝有蒸餾水的燒杯中，打開磁力攪拌器，每2 h 換一次水，透析1～2 d，最終得到的樣品即為杏鮑菇的精多糖溶液，烘干可得多糖樣品。

（3） 多糖含量的測定。苯酚硫酸法測多糖：向多糖樣品中加入100 mL 純水溶解，取2 mL 加于試管中，另取一空試管加入2 mL 蒸餾水，向其中加入1 mL 質量分數為6%的苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，搖勻后靜置5 min，置于100 ℃的水浴鍋中水浴15 min，冷卻至室溫，并于波長490 nm 處測量樣品吸光度，并根據回歸方程計算多糖含量。

1.2.6 高效液相色譜法檢測多糖中單糖組分

稱取適量的凍干多糖樣品，加入濃度為2 mol/L的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，置于120 ℃下水解120 min，用氮吹儀吹干。

向試管中加入5 μL 單糖標準品，混勻。加入濃度為2 mol/L 的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，與樣品同時在120 ℃條件下水解120 min，再用空氣泵吹干。向處理后的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1- 苯基-3- 甲基-5- 吡唑啉酮（PMP） 試劑和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液各0.5 mL，混勻，置于70 ℃中水浴30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL，混勻。加入氯仿0.5 mL，充分振蕩萃取，置于5 000 r/min 的離心機中離心5 min去除氯仿層，共萃取3 次。水層（不低于0.4 mL）用0.22 μm 濾膜過濾后，待上機。

儀器條件：色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1 mol/L pH 值6.8 磷酸鹽緩沖液（PB），乙腈為82∶18（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量10 μL，波長為245 nm。

1.3 數據分析

所有的數據都用平均值±標準差（X±S） 來表示，Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同牛蒡含量對杏鮑菇多糖質量濃度的影響

牛蒡含量對發酵液中多糖質量濃度的影響見圖1。

圖1 牛蒡含量對發酵液中多糖質量濃度的影響

由圖1 可知，當牛蒡含量為1%～5%時，發酵液多糖含量會隨著牛蒡含量的變化而變化，多糖質量濃度先逐漸升高，在牛蒡含量為3%時，達到最大值，為2.38 mg/mL，隨著牛蒡含量的再度升高，多糖質量濃度則呈現下降趨勢。

2.1.2 裝液量的確定

裝液量對發酵液中多糖質量濃度的影響見圖2。由圖2 可知，當裝液量體積為60～140 mL 時，發酵液多糖質量濃度會隨著裝液量的變化而變化，多糖含量先逐漸升高，在裝液量為100 mL 時，達到最大值，為2.41 mg/mL ，隨著裝液量的再度升高，多糖質量濃度則呈現下降趨勢。

圖2 裝液量對發酵液中多糖質量濃度的影響

2.1.3 溫度的確定

溫度對發酵液中多糖質量濃度的影響見圖3。

圖3 溫度對發酵液中多糖質量濃度的影響

由圖3 可知，當溫度為24～32 ℃時，發酵液多糖質量濃度隨溫度的變化而變化，多糖質量濃度先逐漸升高，在溫度為28 ℃時，達到最大值，為2.39 mg/mL，隨著溫度的再度升高，多糖質量濃度則呈現下降趨勢。

2.2 Box-behnken 試驗設計

Box-behnken 試驗設計方案及通過具體試驗得到的多糖含量的預測值與實際值。

設計方案和結果見表2。

表2 設計方案和結果

2.3 回歸方程的建立和方差分析

對上表中的數據進行整理分析，可得三因素裝液量（X1）、溫度（X2）、牛蒡含量（X3） 的回歸方程：

試驗結果的方差分析見表3，杏鮑菇多糖質量濃度預測模型的可靠性分析見表4。

表3 試驗結果的方差分析

表4 杏鮑菇多糖質量濃度預測模型的可靠性分析

由表3、表4 可知，該模型的p 值＜0.01，所以該模型具有極顯著影響；此外，該模型的失擬向p值＞0.05，不具備顯著影響。X1和X3的p 值＜0.01，反映出X3和X1對多糖質量濃度的變化有著極顯著影響，而X2的p 值＜0.05，說明溫度水平變化對多糖質量濃度有著顯著影響；最后，X2X3的p 值＞0.05，表明溫度和牛蒡含量交互作用對多糖質量濃度影響不顯著，X1X3的p 值＜0.01，表明裝液量和牛蒡含量的交互作用對多糖質量濃度的影響極顯著，而X1X2的p 值＞0.05，說明裝液量和溫度進行交互作用對多糖質量濃度無顯著影響。模型決定系數R2為0.999 1，經校正后的決定系數R2Adj為0.998 0，由此可得知該模型的擬合程度較好，具有可靠性。

2.4 因素間的交互作用分析

使裝液量、溫度、牛蒡含量3 個影響因素中的一個保持不變，在此基礎上分析其他2 個因素的交互作用對多糖質量濃度的影響，得到的等高線及響應面圖。

裝液量、溫度和牛蒡含量兩兩之間交互作用對多糖含量影響的等高線圖和三維圖見圖4。

圖4 裝液量、溫度和牛蒡含量兩兩之間交互作用對多糖質量濃度影響的等高線圖和三維圖

由圖4 可知，等高線與圓形越接近，說明對多糖質量濃度的影響越小，由此可以得知，這3 個因素兩兩之間交互作用中，裝液量和牛蒡含量的交互作用對多糖質量濃度影響最大。

除此以外，3 個曲線都呈拋物線形，單個因素影響程度的大小可以通過響應面圖中曲線的變化幅度來判斷，曲線越陡，說明這個因素影響程度越大，由此可以得知3 個因素的影響程度大小依次為裝液量＞牛蒡含量＞溫度，因此試驗的優化方法具有可行性。

2.5 優化后的最佳條件及結果

通過對上面數據的分析，可以對牛蒡杏鮑菇液體發酵工藝條件進行改良，得到最佳提取工藝為牛蒡含量占總裝液量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時，得到的多糖質量濃度最大為2.39 mg/mL。

2.6 多糖中單糖組分的檢測

杏鮑菇多糖單糖組分含量結果見表5。

表5 杏鮑菇多糖單糖組分含量結果/mg·kg-1

結果表明，發酵液多糖單糖組分包含甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。譚霄等人[13]采用高效液相色譜- 蒸發光散射法分析測定杏鮑菇多糖的單糖組成，發現杏鮑菇多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，與此次測定相比多了核糖、鼠李糖和巖藻糖。發酵液多糖單糖組分含量中，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量較高，其中葡萄糖的含量最高。薛令坤等人[14]研究杏鮑菇多糖發現，葡萄糖含量較甘露糖、半乳糖含量高，與該研究結果基本一致。

3 結論

（1） 通過單因素試驗，可以得出當培養基中牛蒡含量達3%時，多糖質量濃度最高為2.38 mg/mL，裝液量為100 mL 時，多糖質量濃度達到最大值為2.41 mg/mL，培養溫度為28 ℃時，多糖質量濃度達到最大值為2.39 mg/mL。

（2） 采用響應面方法優化后，得出最佳方案為牛蒡含量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時，預測得到的最大多糖質量濃度為2.39 mg/mL。

（3） 通過對發酵液的粗多糖進行純化后，用高效液相色譜法測定其單糖組分，得到發酵液多糖中主要有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等多種單糖，其中葡萄糖含量最高。